巨噬细胞来源的胞外囊泡在脓毒症急性肾损伤内皮细胞功能紊乱中的作用及其调节机制

Sepsis caused by lipopolysaccharide (LPS) is a common cause of acute kidney injury (AKI) with high mortality. Significant macrophage infiltration and endothelial cell injury were observed in AKI. Recent studies have demonstrated a crucial role of Nlrp3 inflammasomes in the development of endothelial dysfunction and injury under various pathological conditions. In our in vitro experiments, we found that extracellular vesicles (EVs) secreted by LPS-activated macrophages but not LPS alone induce expression of Nlrp3 inflammasomes and injury in endothelial cells. EVs play an important role in cell-cell communication and functional regulation. However, the role of macrophage-derived EVs in endothelial homeostasis remains largely unknown. Here, cell experiments and conditional knockout mice will be used to test whether or not the inflammasome components can be secreted into EVs derived from macrophages and then EVs transfer these proteins into endothelial cells causing endothelial inflammation and injury. In addition, we will examine whether the biogenesis and release of EVs are controlled by CD38 signaling pathway via regulation of lysosome function. The results of this study will provide new insights into the mechanism of endothelial cell injury in septic AKI, and lay a theoretical foundation for the use of EVs as a therapeutic target for AKI or a biomarker for early diagnosis.

内毒素脂多糖(LPS)诱导的脓毒症是急性肾损伤(AKI)的常见病因，死亡率极高。AKI时肾脏病理可见显著的巨噬细胞浸润和内皮细胞损伤。研究证实Nlrp3炎症小体在各种病理条件下的内皮细胞损伤中发挥了重要的作用。我们前期实验发现，LPS刺激下巨噬细胞分泌的胞外囊泡(EVs)显著上调内皮细胞Nlrp3炎症小体的表达和内皮细胞的死亡，但LPS单独刺激的内皮细胞无明显上述现象。EVs是新近发现的细胞与细胞之间信号传导的重要媒介，但巨噬细胞来源的EVs在内皮细胞稳态中的作用目前仍不清楚。因此我们拟采用细胞实验和条件性基因敲除小鼠，探讨LPS刺激的巨噬细胞是否通过释放包含有炎症小体的EVs，引起内皮细胞的炎症和损伤；且该释放过程是否受到CD38信号通路介导的溶酶体功能的调节。本研究的结果将为脓毒症AKI中内皮细胞的损伤机理提供新的见解，并为EVs作为AKI未来治疗靶点或早期诊断的生物标志奠定理论基础。

研究背景：急性肾损伤（AKI）是临床常见的综合征，脓毒症和顺铂（CP）是引起AKI的常见病因。外泌体是近年来发现的一种新的细胞间信号传递介质，携带的有害内容物可导致肾损伤，但外泌体在AKI发病机制中的作用仍未阐明。本课题以外泌体为研究核心，从巨噬细胞来源的外泌体对内皮细胞的损伤，以及TFEB介导的外泌体调控进行探讨。..研究内容：.一、探讨AKI时巨噬细胞来源的外泌体在肾小球内皮细胞损伤中的作用。.1..体外实验：LPS刺激巨噬细胞，检测外泌体的分泌；将巨噬细胞来源的外泌体与内皮细胞共培养，观察内皮细胞损伤情况；ASM抑制剂预处理，观察LPS刺激下巨噬细胞外泌体的分泌变化。.2..体内实验：运用野生型和ASM+/-敲基因小鼠建立LPS-AKI模型；将巨噬细胞来源的外泌体注射入小鼠体内，观察肾脏损伤情况。.二、探讨AKI时TFEB对TECs外泌体分泌的调控机制。.1..体外实验：顺铂刺激TECs，检测外泌体的分泌；将提取的外泌体与正常TECs共培养后观察TECs的损伤；分别给予TFEB激活剂和TFEB-siRNA预处理，观察顺铂刺激下TECs细胞损伤，多泡体、溶酶体和外泌体的表达变化。.2..体内实验：构建CP-AKI小鼠模型，注射TECs特异性TFEB-siRNA慢病毒后观察肾脏损伤，肾组织内多泡体、溶酶体和外泌体的表达变化（实验进行中）。..重要结果：.结果一：.1.体外实验：LPS刺激下巨噬细胞分泌外泌体增加，巨噬细胞来源的外泌体导致内皮细胞损伤；抑制ASM可减少外泌体的分泌和减轻内皮细胞损伤。.2.体内实验：LPS-AKI小鼠肾脏中，巨噬细胞浸润增加，外泌体分泌增加；注射巨噬细胞来源的外泌体可导致肾脏损伤；ASM+/-敲基因小鼠肾脏损伤减轻。.结果二：.体外实验：顺铂刺激下TECs分泌外泌体增加，损伤周围正常TECs；TFEB激活可减轻TECs损伤，促进溶酶体合成和多泡体降解，从而减少外泌体的分泌。..结论：1. 脓毒症AKI时巨噬细胞浸润增加，分泌外泌体增多，外泌体被内皮细胞内化并加重细胞损伤。2. TFEB经由多泡体-溶酶体途径调控外泌体分泌，AKI时对TECs发挥保护作用。外泌体的分泌和调控在AKI的发病机制中发挥了重要的作用。