微球化重组Mcl1/GDNF基因对老年耳蜗细胞损伤的修复作用

老年性聋是最常见的感音神经性聋，听觉功能下降极大地影响了日益增多的老年人的生活质量。由于耳蜗组织一直被认为是分裂期后终末分化的组织，细胞死亡后不能再生，如何使损伤的耳蜗细胞尽快恢复、避免死亡，成为学者们关注的焦点。促凋亡调控基因Bax表达增强是我们最新发现的老年耳蜗早期改变的细胞生物学特征，本项目拟选择抗细胞凋亡的上游调控基因McL1和抗老年耳蜗细胞损伤主要因素-自由基作用的GDNF基因构成重组子，将制备的微球化重组Mcl1/GDNF基因脂质体置入耳蜗圆窗龛，使微球缓慢释放的重组Mcl1/ GDNF基因脂质体经完整的耳蜗圆窗膜渗透到内耳，将目的基因转染老年耳蜗细胞，提高外源基因在内耳的表达水平，使其达到修复老年耳蜗细胞损伤、恢复听功能的作用。该研究对发现修复老年耳蜗细胞损伤的目的基因及建立最佳的基因内耳导入方法，降低老年性聋发病率，具有极大的临床应用价值和重要的社会意义。

背景 老年性聋是最常见的感音神经性聋，听觉功能下降极大地影响了老年人的生活质量。耳蜗基底膜感觉细胞的损伤是老年性聋的主要病理改变，损伤的毛细胞通过凋亡和坏死两种方式死亡，凋亡为老年耳蜗毛细胞死亡的主要方式。Mcl-1为Bcl-2家族抗细胞凋亡的主要调控基因之一，其在老年耳蜗表达水平下降。我们以Mcl-1为抗细胞凋亡的目的基因，观察其在大鼠内耳表达及对老年性聋的防护作用。.方法 将构建的Mcl-1和绿色荧光蛋白基因(pEGFP) 真核表达质粒置入大鼠耳蜗圆窗龛，经完整圆窗膜导入内耳细胞。分别于手术前和手术后应用电位反应测听仪检测不同频率短声诱发大鼠双侧听性脑干诱发电位反应(ABR)阈值。采用细胞核DNA荧光染料碘化丙锭(PI) 染色耳蜗基底膜细胞, 荧光显微镜下观察Mcl-1/pEGFP质粒在大鼠耳蜗基底膜细胞中的表达及内耳细胞核形态学变化。采用蛋白印迹和定量PCR(Quantitative RT-PCR) 方法检测手术后Mcl-1基因在耳蜗基底膜细胞蛋白和mRNA水平表达的变化。采用F-actin与PI双重染色法，进行Mcl-1基因内耳导入3m后耳蜗基底膜损伤毛细胞的定量观察, 计数凋亡、坏死的毛细胞。采用细胞色素C与PI双重染色法，观察Mcl-1基因内耳导入3m后，耳蜗基底膜细胞色素C阳性标记毛细胞数量的变化。.结果 Mcl-1基因内耳导入后15d，大鼠耳蜗感觉细胞和支持细胞的胞浆部位可见到明显的绿色荧光标记物。Mcl-1/pEGFP质粒不仅在大鼠的手术耳耳蜗基底膜细胞表达，也能在对侧非手术耳细胞内表达。Mcl-1的转染明显提高其在老年大鼠耳蜗细胞mRNA 和蛋白水平的表达。重要的是，Mcl-1基因的内耳导入减少了老年大鼠耳蜗基底膜毛细胞损伤的数量和提高了听觉功能。Mcl-1基因导入3个月后，治疗耳的耳蜗基底膜毛细胞损伤数目少于老年大鼠对照耳17.15%±11.5，不同频率短纯音诱发的ABR阈值较老年大鼠对照耳的平均值降低12.7±3.21 dB。进一步研究发现，Mcl-1对老年听觉退行性变的防护作用主要与耳蜗细胞凋亡的抑制相关，凋亡的抑制作用发生在细胞的线粒体水平。.结论 Mcl-1表达的调控能够减轻老年耳蜗退行性改变，该研究对发现修复老年耳蜗损伤的目的基因及建立最佳的基因内耳导入方法，降低老年性聋发病率，具有极大临床应用价值和重要的社会意义。