包埋GDNF的PLGA/壳聚糖双壁微球的制备及其促周围神经损伤修复的研究

Glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF) plays a critical role in peripheral nerve regeneration. However, the application of GDNF in promoting peripheral nerve regeneration was limited by its short biological half-life and its vulnerability to structural disruption, leading to loss of bioactivity. Therefore, protein drug delivery systems are needed not only to improve the biological utilization of GDNF by sustained release of bioactive GDNF to target site, but also to protect its bioactivity from degradation by direct exposure to harsh environments. In recent years, microspheres-based drug delivery systems, fabricated by biodegradable synthetic polymers such as poly(lactide-co-glycolic acid) (PLGA), have been widely reported in previous studies. However, PLGA have several inherent flaws, such as acidic degradation products and initial burst of drugs from PLGA microsphere.On the basis of our previous fabrication of chitosan microspheres, We propose to: ①The fabrication and evaluation of GDNF-PLGA microsphere; ②The fabrication of GDNF-PLGA/chitosan double-walled microspheres by modified emulsion-ionic cross-linking method; ③Explore the effect of the GDNF-PLGA/chitosan double-walled microspheres on the functional recovery of rat sciatic nerve crush injury model (5mm).This study will provide a new treatment strategy in the peripheral nerve regeneration.

胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）在周围神经再生过程中起重要作用。然而，应用GDNF修复神经损伤面临以下挑战：（1）生物半衰期短，不能有效促进神经再生；（2）易遭受化学结构破坏而失去生物活性。因此，给GDNF提供一种安全有效的载体是必要的。近年来，以聚乳酸-聚乙醇酸共聚物（PLGA）为主要原料制备的微球类缓释载体为蛋白药物的释放带来新的希望。然而，PLGA微球的高“突释量”和酸性降解产物均限制了在周围神经损伤修复方面的广泛应用。本项目在前期成功研发壳聚糖微球的基础上，拟：①制备包埋GDNF的PLGA微球，并检测相关性能；②采用改良的乳化交联技术制备包埋GDNF的PLGA/壳聚糖双壁微球，并检测相关性能；③探讨PLGA/壳聚糖双壁微球对大鼠挤压伤模型（5mm）的修复效果。本研究为临床应用GDNF，或将其复合于组织工程支架修复周围神经损伤，提供一种新的思路和治疗策略，具有重要的临床意义。

周围神经损伤后的再生能力有限，主要与以下两个方面有关：（1）神经元丧失再生能力；（2）不利的再生微环境。为了提高神经元的再生能力，其中一个有效治疗策略是在神经损伤部位给予外源性神经营养因子。其中胶质细胞源性神经营养因子（Glial cell-derived neurotrophic factor，GDNF）是雪旺细胞分泌的一种神经保护性生长因子，不仅可以调控感觉和运动神经元的生物活性，还可以促进轴突再生。然而，直接给予外源性GDNF的修复效果并不理想，面临以下挑战：（1）GDNF生物半衰期短；（2）易失去生物活性。因此，寻找一种有效的药物缓释载体至关重要。近年来多种人工和天然聚合物制备的蛋白药物载体在医药缓释领域得到广泛应用。其中聚乳酸-羟基乙酸共聚物（Poly(lactide-co-glycolide，PLGA) 是最受关注的一种材料。然而，PLGA多聚物自身存在的一些不利因素，限制了在组织工程修复领域，尤其是神经领域的应用。例如，PLGA在降解过程中产生羟基乙酸和乳酸，降低了周围微环境的pH值，导致包埋的蛋白药物丧失生物活性；此外，经 PLGA材料制备的微球具有高“突释”率，可快速将包埋的蛋白药物释放到周围环境中，使药物接近或者超过中毒剂量，不利于周围神经损伤后早期轴突的再生。本课题组应用“乳化交联”技术，成功制备了一种包埋GDNF的PLGA/壳聚糖双壁微球。应用扫描电镜、激光共聚焦显微镜、缓释性能检测及体外生物活性等检测方法，我们发现经不同壳聚糖浓度制备双壁微球，尤其是2%、3%壳聚糖浓度制备的微球，可显著降低PLGA微球的高“突释率”，中和PLGA微球的酸性降解产物，持续缓释具有生物活性的GDNF。在体外实验基础上，将双壁微球与神经导管联合，修复大鼠坐骨神经缺损模型。通过神经形态学和功能学两方面检测显示：双壁微球组可有效提高再生轴突的质量，达到接近自体神经移植组的修复效果。该项研究结果表明：双壁微球组在体内可持续缓释具有生物活性的GDNF，加快神经再生速度，促进神经再生。本研究为下一步在神经再生领域的临床应用奠定坚实地实验基础。