遗传性多发性外生骨疣家系中EXT基因致病突变位点鉴定及动物模型构建

Hereditary Multiple Exostosis is an autosomal dominant disease which induces the multiple exostosis in skeletal system by influencing cartilaginous bone process. The mutations of EXT1 and EXT2 are the genetic cause of HME. We found a HME family in Guangxi Zhuang Autonomous Region, and the pathogenic mutation is still undiscovered. Here, we plan to screen the DNA sequence of exons, intron and exon spliced regions of EXT1 and EXT2 in HME family in order to screen pathogenic mutation site. After that, precise gene editing mouse model harboring the same mutant characteristics with HME family was established via CRISPR/Cas9 gene editing system. We will investigate the pathological characteristics of HME gene editing mouse by immunohistochemical, X-ray and pathological section staining and compare with that of HME family, for revealing the genetic cause and also for certificating the established gene editing mouse is a reliable disease model for precise recapitulation of human HME. HME mouse model is an important biomedical research basis of investigation into pathogenesis and disease development mechanism，development of new therapy, discovery of new drug targets and evaluation of preclinical pharmacodynamics.

遗传性多发性外生骨疣（Hereditary Multiple Exostosis, HME）是影响软骨化骨过程而造成骨骼系统产生多发性外生骨疣的常染色体显性遗传病。EXT1和EXT2基因突变是引起HME的遗传因素。申请者在广西地区发现了一例HME家系，其致病突变位点仍不清楚。本项目拟测序分析HME家系成员EXT1和EXT2基因外显子以及内含子外显子拼接区域的DNA序列，鉴定致病突变位点。然后基于CRISPR/Cas9基因编辑系统制备与该家系具有相同突变特征的精准基因编辑小鼠，并通过免疫组化、X光分析、病理切片染色等方法研究HME小鼠的病理特征，分析其病理表现与HME家系的相似度，验证鉴定位点的致病性，揭示HME家系致病的遗传病因，证明基因编辑小鼠可以模拟人类HME疾病，为探索HME发生和发展机理、研制新的治疗方法、发现药物新靶点以及临床前药效学评价等生物医学研究奠定基础。

背景：遗传性多发性骨软骨瘤（Hereditary Multiple Exostoses, HME）是一种常染色体显性遗传病，常导致患者身材矮小和骨骼畸形，其主要致病基因为EXT1，但目前HME的发病机理和机制仍不清楚。本研究基于CRISPR/Cas9技术构建了Ext1+/-基因敲除小鼠模型，以探索EXT1基因的更多生物学功能，同时为研究HME发病机理，发现药物新靶点等生物医学研究提供理论依据。内容与方法：靶向小鼠Ext1基因设计了两条sgRNA，对原核时期受精卵胞质注射sgRNA和Cas9蛋白，经胚胎移植后获得F0代Ext1基因敲除小鼠，扩繁后对F2代Ext1+/-基因杂合突变小鼠进行表型鉴定。通过qPCR、WB和IHC检测Ext1+/-基因敲除小鼠Ext1基因的表达水平，X-ray分析Ext1+/-基因敲除小鼠骨骼的形态特征，膝关节病理切片检测关节软骨发育情况，同时对Ext1+/-基因敲除小鼠和野生型小鼠的体重和体长进行记录。重要结果：我们获得了两只F0代Ext1基因敲除小鼠，经过繁育得到了Ext1基因杂合缺失46 bp且能稳定遗传的小鼠品系。Ext1+/-基因敲除小鼠Ext1 mRNA的表达水平明显低于野生型小鼠，肝脏和膝关节中蛋白表达水平与野生型小鼠相比无统计学差异，但IHC实验表明Ext1+/-基因敲除小鼠的膝关节软骨细胞中EXT1蛋白的含量低于野生型小鼠。HE染色发现Ext1+/-基因敲除小鼠心脏、肝脏、肺、肾脏和膝关节等组织形态结构正常。X-ray分析发现有14只雄性Ext1+/-基因敲除小鼠在尾椎附近出现异常显影，CT值为200 Hu左右。此外Ext1+/-基因敲除小鼠的体重低于野生型小鼠，体长无显著差异。结论：本研究成功构建了Ext1+/-基因敲除小鼠模型，Ext1+/-基因敲除小鼠的体重低于野生型小鼠。未在Ext1+/-基因敲除小鼠骨骼中发现骨软骨瘤，但在Ext1+/-基因敲除小鼠中出现了雄性性别依赖的异常显影，其CT值介于小鼠肋骨与脊柱之间，表明出现了骨发育异常现象。