耐药基因blaCTX-M在牛源大肠杆菌的传播机制

Diseases such as calf diarrhea and mastitis caused by Escherichia coli in veterinary clinic are worldwide problems. Drug resistance poses a great challenge to cattle disease control and public health safety. Gene blaCTX-M is the main cause of drug resistance producing and transmission of cephalosporal antibiotics, but the transmission mechanism of blaCTX-M gene in bovine Escherichia coli is still unclear. Based on the previous blaCTX-M genotyping work, the prevalence and distribution of blaCTX-M gene in different breeding models will be analyzed through the determination of phenotype and genotype of drug resistance in Escherichia coli, and the transmission and homology of drug resistant clones will be analyzed through sequencing and molecular typing. Then, the transform route and types of drug resistant plasmids will be determined by S1-PFGE and plasmid conjugation tests, and the phylogenetic relationships among replicas will be revealed by analyzing the multilocus sequence typing of replicas and plasmids. Furthermore, through the analysis of genetic environment and drug resistance element, the effect of blaCTX-M gene transmission would be determined. The project will clarify the relationship between the prevalence of blaCTX-M gene and cephalosporin resistance. It is important for revealing the transmission mechanism of blaCTX-M gene between animals and environment in different breeding modes, which can effectively prevent the spread of drug resistance and high efficiency use of drug. It is of great significance to ensure the safety of food and public health.

大肠杆菌引起的犊牛腹泻、乳房炎等疾病是兽医临床面临的世界性难题，耐药性对牛病防治与公共卫生安全带来极大挑战。blaCTX-M基因是导致头孢类抗生素耐药性及其传播的主要原因，但其在牛源大肠杆菌中的传播机制仍不清楚。项目在前期blaCTX-M基因分型的基础上，通过细菌耐药表型和基因型测定，分析blaCTX-M基因在不同养殖模式下的流行与分布特征；通过核酸序列和分子分型研究耐药性克隆传播及同源性关系；以脉冲场凝胶电泳和接合试验确定质粒类型和转移途径，并进行复制子和质粒多位点序列分型，揭示复制子之间的亲缘进化关系；进一步通过基因环境和耐药元件分析，明确其对blaCTX-M基因传播的影响。项目研究可阐明blaCTX-M基因的流行与头孢菌素耐药性的关系，揭示blaCTX-M基因在不同养殖模式下动物和环境之间的传播机制，为有效阻止耐药性传播和高效用药提供理论依据，对保障食品与公共卫生安全具有重要意义。

本项目旨在揭示牛源大肠杆菌耐药基因blaCTX-M在牛肠道和环境中的流行分布特点，阐明blaCTX-M的水平传播机制。牛肠道菌群耐药性的宏基因组研究结果表明，以肉牛、奶牛为代表的集约化、抗生素压力集中区域的养殖模式比以牦牛为代表的纯放牧、抗生素低压力区域养殖模式的耐药情况更为严重。按照16s及MALDI-TOF-MS飞行时间质谱的一致鉴定结果，对四川、新疆、青海、甘肃等地分离的细菌种类进行判定，其中大肠杆菌606株，临床分离率88.60%。K-B法对大肠杆菌分离株进行药敏试验，结果表明同时对5种以上抗生素耐药的菌株有39株，占5.27%，其中，肉牛源耐药菌株6.03%，奶牛源耐药菌株13.44%，牦牛源耐药菌株3.82%。 大肠杆菌分离株中，氨苄西林、四环素、头孢噻吩耐药株比例分别为17.99%、12.21%和11.22%，为耐药性最普遍的抗生素。通过PCR法检测了220株头孢菌素耐药株的CTX-M基因型和整合子基因型，并对CTX-M阳性菌株进行种族进化关系分析，结果显示，CTX-M阳性菌株以CTX-M-55、CTX-M-79和CTX-M-14为主；91株CTX-M阳性大肠杆菌中有85株菌株携带Int1，占93.41%；种族进化关系分析显示，CTX-M阳性菌株主要分布在B1群，占75.82%。从新疆和甘肃的牛样本中筛选出5株blaCTX-M-55阳性的多药耐药菌株，通过三代测序技术获得完整的基因组数据，对携带blaCTX-M-55抗性基因的质粒的遗传环境进行了定位比较，通过生长曲线试验、质粒稳定性和竞争性生长等分析了适应性代偿水平。结果表明，5株大肠杆菌携带blaCTX-M-55基因，并与其他耐药基因相邻，位于IncHI2型质粒上；5株携带blaCTX-M-55的菌株中有4株菌携带共计11个环形中间体；携带blaCTX-M-55基因的供体细菌均能在受体E. coli J53 Azr中水平转移，且转移频率高；携带blaCTX-M-55基因的IncHI2质粒接合子处于竞争优势。研究表明blaCTX-M-55的传播位于IS26介导的复合转座子上，这可能导致blaCTX-M-55基因在牛源性大肠杆菌中水平传播的风险增加，对公共卫生及牛病防控造成威胁。