LncRNA-Arg调控Cathepsin S活性抑制腹主动脉瘤发生的机制研究

Abdominal aortic aneurysm (AAA) has not been prevented and treated by effective.drug, when the pathogenetic mechanism of AAA has not been clarified. But based on our previous research, by contrasted AAA artery wall tissue with normal artery wall tissue we found that the expression of LncRNA-Arg was obviously difference verified that can influence oxidative stress. At the same time Cathepsin S(Cat S) is likely to contribute to the occurrence of AAA while oxidative stress pathway affected the expression of Cat S theoretically. In view of that we hypothesized that LncRNA-Arg regulates the activity of Cat S by influenced the ROS generation of oxidative stress and inhibit AAA product progress finally. This project intends to make LncRNA–Arg recombinant vector transfection into SMCs and abdominal aortic aneurysm model in the mouse, to observe its effect on SMCs and vessel wall of mice aneurysm , and the Cat S structure change, NADPH oxidase activiton, ROS generation，Ang-Ⅱ and find the relationship between them and AAA, confirming LncRNA-Arg is an endogenous protective substance of AAA in the end. This project intends to provide new mechanism and therapeutic target for the occurrence of AAA.

腹主动脉瘤(AAA)尚无有效药物防治是临床治疗难点，其原因在于发生机制尚未阐明，既往我们研究发现与正常腹主动脉壁组织相比AAA瘤壁组织中LncRNA-Arg表达明显降低，并证实其可影响氧化应激通路，由于氧化应激影响Cathepsin S(Cat S)表达且Cat S促进AAA发展，我们提出假说:LncRNA-Arg通过调控氧化应激产物ROS生成影响Cat S表达抑制AAA的进展。本项目拟研究AAA患者与对照者间LncRNA-Arg、Cat S、氧化应激通路的变化情况，制作LncRNA-Arg重组载体转染至人平滑肌细胞及腹主动脉瘤小鼠模型中，观察其在平滑肌细胞中的作用机制及对小鼠动脉瘤血管的影响，以及Cat S结构变化、NADPH氧化酶、ROS、血管紧张素-Ⅱ与AAA发展的关系，从而验证LncRNA-Arg是AAA的一种内源性保护物质，本课题可能为AAA的发生提供新的作用机制和治疗靶点。

本研究首先筛选出三个可能影响腹主动脉瘤发展的长链非编码RNA（lncRNA），将lncRNA通过慢病毒转染至人单核细胞系U937和人主动脉血管平滑肌细胞HAVSMCs，采用qPCR和荧光原位杂交（FISH）检测lncRNAs过表达水平及基因分布，进一步用Western blotting 检测AKT、p-AKT、p38、p-p38、ERK、p-ERK、 PI3K、 p-PI3K 、Stat3、 p-Stat3 、p53、YAP1等因子表达水平，筛查出与腹主动脉瘤进展密切相关的特定lncRNA。动物实验部分，首先建立腹主动脉瘤小鼠模型，将特定的lncRNA：IGHV3OR16-9通过慢病毒转染至实验小鼠体内，取小鼠外周血与主动脉组织，通过qPCR检测IGHV3OR16-9表达水平，并通过HE染色后观察腹主动脉壁组织病理变化。本项目通过设计特定的lncRNA探针组，在HAVSMCs中进行了RNA pulldown实验，选取其中的明显差异条带，进行质谱实验和WB检测，结果表明PKM2 及 YB-1 与IGHV3OR16-9存在相互作用。YB-1是一种固有无序蛋白，是血管平滑肌细胞的分化标志因子，同时也是炎性介质的重要调节因子，可影响动脉粥样硬化相关因子表达。YB-1能通过抑制p53和p16的功能来影响相应通路，因此本团队推测YB-1 通过抑制p53/p21 及 P16/PRB 信号通路，抑制平滑肌细胞衰老，预防 AAA 形成和抑制进展，而 P38 MAPK 可做为潜在的上游因子抑制YB-1 的表达，参与 AAA 发展及 VSMC 衰老的通路，并进行实验进一步深入验证。本研究通过细胞实验和动物实验初步明确了lncRNA对腹主动脉瘤发生进展的影响，以及验证lncRNA相关蛋白功能，最终发现YB-1与人腹主动脉瘤发病机制中的保护作用及其机制。