相同危险因素的下肢缺血患者与正常对照者EPC中miRNA表达差异对VEGF和KDR影响的机制研究

Angiogenesis deficiency in lower limb ischemia is a research difficulty. Our previous studies have found, VEGF significantly enhance the ability of EPCs angiogenesis and improve the situation of lower limb ischemia mouse model. Recent studies showed that the miRNA modified EPCs were significantly enhanced in capabilities of angiogenesis and miRNA can affect the expression of VEGF in mesenchymal.stem.cell. So we propose hypotheses: certain miRNA has the ability to change the angiogenesis of EPCs in treating hindlimb ischemia by affecting the expression of VEGF and KDR. We intend to collect peripheral blood EPCs of hindlimb ischemia patients and normal people with same risk factors, perform microarray analysis of their miRNA, observe changes in expression profiling, screening VEGF and KDR expression related miRNA. Transfected screeninged specific miRNA and anti-miRNA virus into EPCs, and then observe the effects on the ability to promote angiogenesis, and changes of VEGF and KDR, in order to verify the impact by the associated miRNA on the expression of VEGF and KDR and changes in the ability of the EPC angiogenesis. We expect to find a new way to diagnosis of ASO patients and to treat lower limb ischemia.

下肢缺血时血管新生能力不足是研究中的难点，既往我们研究发现VEGF能够增强血管内皮祖细胞（EPCs）的血管新生能力，且能改善小鼠的下肢缺血，新近研究表明：经相关miRNA修饰的EPCs血管新生能力也明显增强，且miRNA可影响间充质干细胞的VEGF表达。故我们提出假说：某些miRNA通过影响VEGF及KDR的表达改变EPCs治疗下肢缺血时促血管新生的能力。我们拟提取下肢缺血患者与具有相同危险因素但未患病的对照者外周血中EPCs并对其行miRNA基因芯片分析，观察表达谱变化，筛选出相关VEGF及KDR表达的miRNA，将包含筛查出的特定miRNA及anti-miRNA的病毒转染到EPCs中，观察其对血管新生能力的影响，以及VEGF与KDR变化，从而验证相关的miRNA对VEGF及KDR表达的影响及对EPC促血管新生的能力的改变，期待为该疾病的诊治提供新的思路。

本研究提取下肢缺血患者与具有相同危险因素（吸烟、高血压 病、高脂血症、糖尿病、BMI≥ 28、年龄大于 45 岁）但未患病的正常人外周血EPCs各50例，并对两组行miRNA 基因芯片分析，将两组标本miRNA表达情况进行比照。选取两组表达谱有显著差异的 miRNA，筛选出与VEGF及KDR表达相关的miRNA。将筛查出的特定miRNA及anti-miRNA的病毒转染到EPCs中，并且建立高脂饮食并下肢缺血的小鼠模型。将移植基因改造后的EPC 注入实验小鼠体内，采用激光多普勒检测小鼠的肢体血流恢复情况及RT-PCR和western blotting，检测局部组织VEGF、KDR、下游因子AKT,FAK,pPLCγ浓度改变情况。此外，我们在收集样本过程中发现部分患者合并腹主动脉瘤疾病，在相同危险因素下，腹主动脉瘤在人群中发病具有一定的差异性，可以联想到此类疾病其具有一定的遗传机制及RNA表达上存在一定差异，具有深刻的研究意义，研究者对此进行了一系列研究，进一步深化及拓展了本课题研究内容。该研究目的在于观察非编码RNA（LncRNA）在腹主动脉瘤（AAA）发病机理中的作用。本研究通过微阵列实验初步比较正常组织与腹主动脉瘤组织中LncRNA及mRNA的表达特点，以及通过qRT—PC进一步验证，并使用计算分析LncRNA与mRNA之间的关系，以及在海拉细胞上测试Lnc-ARG对ALOX5表达的影响，最终发现一系列LncRNA与人们腹主动脉瘤发病机理相关。