慢性心衰时心肌细胞钙循环异常的机制及槐定碱干预作用的研究

Heart failure (HF) is escalating major health problems worldwide. Among a variety of factors, altered intracellular Ca2+ handling by the sarcoplasmic reticulum (SR) plays a crucial role in the pathogenesis of heart failure. Despite extensive effort, the underlying causes of abnormal sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling in heart failure are not clarified. We found that dastolic sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak (due to dissociation of FKBP12.6 from RyR2) and reduced sarcoplasmic reticulum Ca2+ uptake (due to down-regulation of SERCA2a) could contribute to the decreased contractility observed in rat failing hearts. In this study, a rat model of chronic heart failure was used to examine cytosolic Ca2+ induced Ca2+ release (CICR)、sarcoplasmic reticulum Ca2+ content、the expression of the major sarcoplasmic reticulum Ca2+ handling proteins and Ca2+ channel activity at the subcellular and molecular levels by using Patch-clamp、laser scanning confocal microscope、Patch-clamp and laser scanning confocal microscope synchronous recording system software、Electron cryomicroscopy、Calcium sparks image processing technology、Coimmunoprecipitation、real-time quantitative RT-PCR、Western-blot and to investigate whether sophoridine has a cardioprotective effect in a rat model of chronic heart failure and the potential mechanisms for its cardioprotection.

心力衰竭已成为危害人类生命健康最严重的疾病。心肌细胞肌浆网的钙循环异常是心力衰竭发病的主要原因之一，但其确切机制还不甚清楚。我们前期研究发现，慢性心衰大鼠心肌细胞内FK506结合蛋白（FKBP12.6）和钙泵（SERCA2a）的表达下调，由此导致Ca2+泄漏过多和回摄减少，最终造成心肌收缩力降低。本课题拟采用膜片钳技术、激光扫描共聚焦显微镜、膜片钳-共聚焦显微镜联用分析、冷冻电镜技术及钙火花图像处理技术并结合免疫共沉淀、Real-time RT-PCR及Western-blot等手段在亚细胞和分子水平研究慢性心衰大鼠心肌细胞胞浆内钙诱导钙释放、肌浆网内钙容量、钙调控蛋白的表达及钙通道活性等变化及其特征，以期明确钙循环异常致心衰发生的分子机制并在先前研究的基础上探讨槐定碱对心衰心肌细胞保护作用的机制，为此药在临床上的开发及应用提供基础理论支持。

背景：心力衰竭（又称为心衰）是危害人类生命健康最严重的疾病之一。在众多发病因素中，心肌细胞肌浆网内钙离子循环的异常是其发病的主要原因之一，但其确切机制还不甚清楚，亟待进一步加强。目前临床治疗慢性心衰主要以药物为主，传统西药效果显著，但长期使用患者的不良反应明显。因此，探索新的心肌保护药物的工作显得尤为重要。主要研究内容：本研究以大鼠慢性心衰模型作为研究对象，在亚细胞和分子水平上对心肌细胞胞浆内钙瞬变、肌浆网内钙容量以及钙调控相关蛋白表达的变化进行了研究，从而更深入地了解心衰的分子机制并在先前研究的基础上探讨槐定碱对心肌细胞内钙离子，钙通道及钙调节相关蛋白的影响，以期获得其心脏保护作用的机制，并为此药在临床上的开发及应用提供基础理论支持。结果：研究发现，与假手术组比较，心衰组大鼠单个心肌细胞的ICa•L显著降低（P<0.01），钙诱导钙释放过程中的钙瞬变幅度明显下降（P<0.01），咖啡因诱导钙瞬变幅度明显降低（P<0.01），单个心肌细胞Fluo-5N/AM染色后荧光强度显著降低（P<0.01）；与假手术组相比，心衰组大鼠心肌细胞RyR2，PLB的表达均无显著差异（P>0.05），FKBP12.6、SERCA2a、NCX、DHPR的表达均明显降低（P<0.01）。RyR2辅助蛋白Calmodulin、Calsequestrin、sorcin、triadin、junction、PP1 and PP2A等的表达亦明显降低（P<0.01）。与心衰组比较，中剂量（5mg/kg）和高剂量（10mg/kg）槐定碱干预组大鼠单个心肌细胞的ICa•L明显加强（P<0.01），钙诱导钙释放过程中的钙瞬变幅度明显升高（P<0.01），咖啡因诱导钙瞬变幅度明显升高（P<0.01），单个心肌细胞Fluo-5N/AM染色后荧光强度显著升高（P<0.01）；与心衰组比较，中剂量和高剂量槐定碱干预组大鼠心肌细胞DHPR表达明显升高（P<0.01）。结果表明，钙调控相关蛋白的表达异常是导致心衰时心肌细胞钙循环异常的主要原因；槐定碱可通过恢复心衰大鼠心肌细胞DHPR的表达来改善钙循环，进而改善心功能。