反义寡聚脱氧核苷酸抑制技术在植物学领域的开拓及其作用机理的研究

Antisense oligodeoxynucleotide (AODN) inhibition technology was invented in seventies last century in US by Zamecnik and Stephenson for inhibition of virus replication in animal cells. It has been rapidly developed and widely used in animal research, for instance, as an important emerging therapeutic approach in clinical medicine and cancer treatment. The method has become one of the most popular methods in studies of gene function in animal science mainly due to its high efficiency, simplicity and specificity. However, in plant biology the method has been restricted to a very limited application because of plant cell walls which seriously block an efficient delivery of AODN to plant cells. Recently, our group has found a breakthrough method for AODN inhibition technology in plant biology. The AODN delivery is dramatically enhanced in an environment of sugar solutions. The method holds promising in many applications such as a rapid antecedent to time-consuming transgenic studies and a high potential to bring good economic and environmental benefits in plant-related industries and agriculture.

反义寡聚脱氧核苷酸 (AODN) 抑制技术是上世纪七十年代由美国学者Zamecnik和Stephenson发明的方法。该方法起初用于抑制动物细胞中的病毒复制。之后，在医学界迅速得到了广泛的发展和应用，包括癌症的临床治疗。该方法已成为动物学中基因功能研究的最流行方法之一。然而，在植物学领域，此方法的应用却受到限制，因为植物细胞壁的存在严重阻碍植物细胞对AODN的摄取。最近，申请者团队发现，在一定浓度糖的环境下植物细胞可有效地吸收AODN，这给该技术在植物学学科领域的应用带来了希望。然而，该技术在植物细胞中的作用机理有待研究，比如，AODN与mRNA结合的最佳位点，它的最佳长度，在细胞内外的稳定性，进入植物细胞以及抑制蛋白合成的机理等。了解这些科学问题，会大大帮助开拓此方法在植物学领域的应用，为植物有关的领域带来经济和绿色环境效益。

在自然基金会资助期间，我们按照在科学基金计划书中的承诺，完成或超额完成了承诺的任务，在世界知名期刊Molecular Plant (封面文章) 和Plant Journal上各发表论文一篇，授权国际专利一项，派两名博士生和一名硕士生去瑞典农业大学进行了进修，邀请两位高访教授去瑞典进行了科技交流。具体有如下发现：.1. 惊奇发现寡聚脱氧核苷酸 (ODN) 能影响DNA的甲基化程度，通过表观遗传的原理，上调基因的表达水平。可以用该结果与目前的CRISPR沉默技术相兼容来研究植物的基因功能。.2. 成功发现反义寡聚脱氧核苷酸 (AODN) 可以与基因启动子区域DNA结合形成三联体，从而影响RNA聚合酶的转录。另外，发现双链ODN可以通过挤压渗入 (infiltration) 方法导入植物细胞，作为诱骗性寡脱氧核苷酸捕捉特定的转录子，并去除该转录子对基因表达的作用。此结果为缩短研究启动子上的cis-element功能及相关的转录子功能提供了一个新的手段。.3. 编导区域的AODN能有效抑制各种基因的蛋白表达水平，并且不同长度的 AODN可通过挤压渗入 (infiltration) 方法导入植物细胞。此结果与农杆菌挤压渗入 (agro-infiltration) 方法有完美的兼容性，从而通过瞬时沉默或瞬时过表达方式来研究基因的功能，以取代通过转基因方法来研究基因功能。.4. 摸清了AODN抑制基因表达的有效性和专一性。发现一个针对看家基因的18碱基AODN，其抑制效果能使植物细胞死亡，两个碱基不匹配即可逃脱AODN的抑制。.5. 成功用AODN技术来取代抗生素、除草剂在植物分子育种领域的使用，可以大大减少化学物质对环境污染。.6. 由于新的发现，比如ODN对表观遗传，启动子，转录子的影响，挤压渗入 (infiltration) 方法可以向植物细胞导入ODN，我们对AODN在植物中的作用机理有了新的认识。另外，大量实验表明，18碱基非修饰AODN是该技术抑制基因表达的最佳选择之一。