MSCs-肝细胞的三维共培养及其用于生物人工肝的实验研究

本项目以MSCs的多向分化潜能和已能分化为肝细胞的实验为依据，以近年来被证明的免疫调节功能为线索，以重型肝炎/肝衰竭的免疫发病机制为基础，设计进行以MSCs用于生物人工肝为目的的实验研究。拟首先在普通条件下进行MSCs、肝细胞、kupffer细胞的共培养，在利用肝细胞培养环境及必要的辅助刺激诱导MSCs向肝细胞分化的同时，观察MSCs对培养肝细胞的作用和kupffer细胞在MSCs调节免疫功能发挥中的作用；在此基础上，进一步以可降解高分子生物材料为支架，以旋转型反应器产生的微重力为条件，进行三种细胞的三维共培养，并以三维共培养的MSCs为核心，组建灌流式实验型生物反应器，系列研究其生物合成、转化代谢及对肝衰竭的作用，综合评价MSCs用于生物人工肝的特性与功能。本项目的完成不仅有可能为生物人工肝提供新的细胞来源，而且有望为其增添新的内涵，最终为重型肝炎/肝衰竭提供更为合理、有效的治疗。

本项目采用MSCs-肝细胞混合三维共培养的方法进行MSCs用于生物人工肝的实验研究。研究首先采用体外两步灌流法，分离到肝细胞和kupffer细胞，细胞保持良好的活性与功能。将肝细胞与Matrigel混合接种于聚合三维支架内，经微重力反应器培养的肝细胞增殖及密度、白蛋白分泌、尿素合成及P450活性明显优于静止状态培养。分别采用骨髓冲洗法、组织贴壁法、胶原酶酶消化法等分离获得骨髓、脐带和脂肪MSCs，流式细胞分析显示，MSCs表达高水平的干细胞的标志物，低表达与造血细胞相关标志物, MSCs可向成脂诱导和成骨诱导,并能诱导为肝细胞。.研究发现，骨髓MSCs和肝细胞混合培养上清对正常或酒精损伤的LO2细胞均有促进增殖和蛋白合成作用，可保护细胞损伤，减少凋亡。体内注射使肝衰竭模型鼠ALT、AST下降，肝组织损害减轻，存活率提高。检测分析显示共培养上清中IL-6、IL-10等细胞因子明显高于对照组。将脐带MSCs注入急性肝衰竭模型鼠脾脏，ALT、AST均显著降低，成活率达80%，血清IL-1b、TNF-a、IL-6水平显著降低，IL-10、IL-1RA水平显著升高。分别直接与间接混合共培养脂肪MSCs与原代肝细胞，发现肝细胞的培养时间与细胞功能明显延长和增强，Transwell间接共培养中的MSCs逐步向肝细胞分化，表达肝特异性基因，具备贮存糖元能力，能保护培养肝细胞免受肝衰竭血清的毒性刺激，MSCs与肝细胞联合移植治疗急性肝衰竭模型效果优于单独肝细胞移植组，间接证明MSCs-肝细胞联合共培养用于生物人工肝可产生良好的肝支持作用。.将MSCs和肝细胞混合培养于三维支架内，两种细胞相互聚集、紧密连接附着于支架上生长，随培养时间延长细胞增殖明显，白蛋白分泌量升高。微重力反应器培养下，MSCs与肝细胞较静止状态培养增殖更好，表明MSCs-肝细胞三维支架共培养策略是用于生物人工肝的可靠方式。在此基础上，采用模拟生物人工肝治疗肝衰竭的体外评价方法，将肝衰竭血浆循环于生物反应器，6小时后循环液中的胆红素明显降低，血氨显著下降，总胆汁酸也明显降低，炎症因子TNF-a、IL-6、IL-10也有明显改变，实验结束后细胞粘附与活性尚好。.上述结果提示，MSCs-肝细胞共培养策略组装的反应器符合生物人工肝的基本要求，具备肝支持作用与免疫调整功能，能有效提高治疗肝衰竭的作用与效果。