热休克蛋白90与雷公藤红素结合部位的关键性基团和构象研究

抑制热休克蛋白90（HSP90）是肿瘤治疗新策略；我们和他人研究表明，雷公藤红素是一种新型的HSP90抑制剂，但对其通过何种机制影响HSP90存在激烈争论，并引起高度关注。申请人和他人最新研究提示，在HSP90分子上存在雷公藤红素结合部位，但关键性基团和构象特征仍不清楚。本项目将1）通过计算机模拟雷公藤红素与HSP90的作用方式，筛选出HSP90上可能与雷公藤红素直接作用的候选基团；2）通过基因突变和表达技术，突变提供候选基团的氨基酸，观察雷公藤红素与突变蛋白及野生型蛋白相互作用差异，进一步确定哪些候选基团是与雷公藤红素作用的关键性基团；3）对确定的关键性基团部位，再用计算机进行分子间作用等的深度分析。本项目以期最终明确HSP90与雷公藤红素结合部位的关键性基团及三维结构特征，为雷公藤红素应用于临床抗肿瘤治疗提供必要的理论基础，并为设计新的HSP90调节剂提供蛋白结构信息。

通过抑制热休克蛋白90（HSP90）发挥抗肿瘤作用是目前肿瘤治疗领域的新方法，大量新的HSP90抑制剂被开发和研究。而中药抗肿瘤药物、雷公藤提取物、三萜类化合物——雷公藤红素作为新型HSP90抑制剂，近年来受到广泛重视，但雷公藤红素是如何影响HSP90，具体机制仍不清楚。本项目预实验提示，在HSP90分子上可能存在与雷公藤红素相结合的部位，但关键性基团和构象特征仍不清楚。.本项目通过生物信息学软件模拟，寻找HSP90与雷公藤红素可能的结合部位及结合位点，对HSP90上关键性的结合位点进行点突变，构建表达野生型和突变型HSP90的原核和真核表达载体，转染细胞，纯化蛋白，从细胞及细胞外水平，观察HSP90突变对雷公藤红素抑制HSP90作用的影响，拟找到并证实雷公藤红素与HSP90结合的关键性基团。.结果发现：1）用我们新构建的IP-FCM技术证实，雷公藤红素能直接导致HSP90复合体上的Cdc37和HSP70解离；2）分子模拟提示，HSP90α二聚体内面可能存在雷公藤红素结合口袋，而雷公藤红素通过其结构中的羧基端与这个结合口袋作用；3）在对HSP90α上两个组成结合口袋的氨基酸位点进行突变后，不仅在细胞水平影响雷公藤红素诱导细胞发生热休克反应、改变HSP90复合体成分，如影响HSP70或Cdc37与HSP90的结合；4）更重要的是，在细胞外水平研究证实，雷公藤红素能直接与HSP90结合，而突变能导致雷公藤红素与HSP90结合的破坏；5）改造雷公藤红素羧基端后，其抑制细胞增殖及诱导热休克反应作用均消失。.本项目首次发现及证实，雷公藤红素能直接结合HSP90，这是本项目最重要的发现。这为HSP90作为雷公藤红素作用靶点提供了有力支持，而且本研究进一步提供了雷公藤红素与HSP90相互作用的亚分子靶点。这些研究结果，将大大推动雷公藤红素作为新型HSP90抑制剂发挥抗肿瘤作用机制研究，为开发新的HSP90抑制剂提供重要结构理论基础。