搜剔肺络法对肺纤维化大鼠Rho/ROCK信号通路的干预及机制研究

Idiopathic pulmonary fibrosis is a chronic, progressive and ultimately fatal pulmonary disease of unknown aetiology. Traditional Chinese Medicine displays invaluable advantages in the treatment of pulmonary fibrosis.The ROCK signalling pathway plays a significant role in the pathogenesis of pulmonary fibrosis and is involved in many aspects of disease development. Differentiation into myofibroblasts, a crucial stage in the pathogenic process, also requires activation through the ROCK pathway. Targeting this pathway could be an effective method to control pulmonary fibrosis.Based on the doctrine of "Lung Luo" and building upon earlier research, this project proposes the hypothesis that pulmonary fibrosis patients have "lung luo dry blood." Using a bleomycin-induced pulmonary fibrosis murine model, the modulation of the Rho/ROCK signalling pathway by Dahuang Zhechong pill is to be assessed, from the organ, cellular, molecular and genetic levels. Immunohistochemistry, ELISA, Western blot, RT-PCR and other molecular biology methods will be employed at different time points, during and after the appearance of fibrosis, to elucidate the mechanism of Soutifeiluo intervention to myofibroblast differentiation and the relationship between dry blood and collagen metabolism.The study would provide the theoretical basis for clinical treatment of pulmonary fibrosis and further enhance the application of Soutifeiluo in the treatment of pulmonary diseases.

特发性肺纤维化是一种原因不明的，慢性进展性、致死性肺疾病。中医药在肺纤维化的治疗中显出不可替代的优势。ROCK信号通路在肺纤维化的发病过程中具有显著的作用，参与肺纤维化形成过程中的多个环节。肌成纤维细胞的分化在此过程中起关键作用，这都需要ROCK信号通路的激活。因此通过干预ROCK通路，降低肌成纤维细胞的分化可能是一种抑制肺纤维化的有效方法。基于“肺系络病”理论及前期基础，本项目提出“肺纤维化患者存在肺络干血”的假说，通过复制博来霉素致肺纤维化大鼠模型，采用免疫组化、ELISA、Western blot和RT-PCR等方法，在肺纤维化形成过程中和肺纤维化形成后，从器官、细胞、分子、基因等多层次多靶点研究大黄蛰虫丸对肺纤维化大鼠Rho/ROCK信号通路的调控，探讨搜剔肺络法对肌成纤维细胞分化的干预机制，及干血与胶原代谢之间的关系。为临床治疗肺纤维化提供理论依据，进一步丰富搜剔肺络法学术内涵。

基于“IPF患者存在肺络干血”假说,观察大黄䗪虫丸对博来霉素致肺纤维化大鼠的防治作用,研究其防治特发性肺纤维化(IPF)的作用机制。将180只健康SD大鼠随机分成空白组（Control,n=15）、模型组（Model，n=35）、阳性对照药组（PFD，n=35）、大黄䗪虫丸大剂量组（DHZC-H,n=35）、大黄䗪虫丸中剂量组（DHZC-M,n=35）、大黄䗪虫丸小剂量组（DHZC-L,n=35），除外Control组，其他各组均通过“一次性气管内滴注博来霉素（5mg/kg）”的方法制备大鼠肺纤维化模型，选取吡非尼酮为阳性对照药。各用药组于造模后第2日开始给药，分别于给药后第1、3、7、14、28日后，各用药组分别随机选择5只大鼠，Control组随机选取3只大鼠，行肺功能检测后，收集血清、肺标本完成取材并标记保存备用；ELISA法检测TGF-β1、TNF-α、RT-PCR法检测EMT相关基因及Smad2/3 mRNA的表达;Western blot法检测p-RohA、ROCK、MLCP、Collagen I/III、CTGF蛋白表达。另外，将100只健康SD大鼠按照上述分组，造模28日后开始给药，分别于给药后第7、14、28日后，各用药组分别随机选择5只大鼠，Control组随机选取3只大鼠，行肺功能检测后，收集血清、肺标本完成取材并标记保存备用；ELISA法检测IL-β1、IL 6、IL 10；RT-PCR法检测ROCK、α-SMA、Collagen I/III mRNA的表达;Western blot法检测TGF-β1、Smad2/3、p-smad2/3、MMPs蛋白表达。在重点观察的2个时相中，DHZC在不同剂量下均不同程度降低了Fibronectin mRNA、p-RohA、ROCK、MLCP、Collagen I/III和p-smad2的表达。在小剂量组中，DHZC还显着降低了α-SMA mRNA、TGF-β1、CTGF、Smad2和p-Smad3的表达。此外。在小剂量组中，博莱霉素诱导的肺纤维化大鼠TGF-β1、CTGF和p-Smad3的水平发生了逆转，这显示了其防治效果比吡非尼酮更显优势。本研究表明,大黄䗪虫丸可通过下调TGF-β1介导的Rho/ROCK及Smad2/3通路来缓解博来霉素致大鼠肺纤维化程度,且此过程可能受到其他与EMT相关信号的影响。