基于Rho/Rock信号通路探讨温肺降浊方靶向VaD大鼠突触损伤修复的分子机制

There is no effective treatment for vascular dementia at present. Synaptic plasticity is the key molecular mechanism of learning and memory,and it is also one of the hottest research fields at present. The studies show that inhibition of Rho/ROCK pathway is an important channel for restoring synaptic remodeling. Previous researches of our group have confirmed that Wenfei Jiangzhuo prescription has good curative effect to treating VaD and can inhibit the expression of Nogo-A protein, while the protein activates the Rho/ROCK pathway. we hypothesize that the prescription may inhibit Rho/ROCK pathway to promote synaptic regeneration of neurons and protect brain neurons in consequence.To observe the expression changes of Nogo-A,NgR,RhoA,ROCKII,MLC,MLCP,PIIa and so on which related with Rho/ ROCK pathway and synaptic remodeling, and the effects of the expressions of the above genes after the intervention using Wenfei Jiangzhuo prescription combined with the RNA interference technology with qRT-PCR, hybridization in situ,Western blot, immunohistochemistry and transmission electron microscopy techniques using VaD rat model in this study. To explore the internal mechanism of improving symptoms of VaD and lay a solid foundation for its better clinical application, at the same time, it also provides a new target and method for the prevention and treatment of VaD.

血管性痴呆（VaD）目前尚无确切有效的治疗方法。突触的可塑性是学习与记忆的关键分子机制，也是目前最被关注的热点研究领域之一。研究表明，抑制Rho/ROCK通路是恢复突触重塑的重要途径。本课题前期研究证实温肺降浊方对VaD疗效显著，能抑制Nogo-A蛋白表达，而该蛋白能激活Rho/ROCK通路。因此我们假说该方可能通过抑制Rho/ROCK通路而促进神经元突触再生，保护脑神经元。本研究通过制备大鼠VaD模型，应用qRT-PCR、原位杂交、Western blot、免疫组化、透射电镜等技术，观察Rho/ROCK通路与突触重塑相关基因Nogo-A、NgR、RhoA、ROCKII、MLC、MLCP、PIIa等基因的表达变化以及温肺降浊方结合RNAi干预后对上述基因表达的影响，探讨该方改善VaD的内在机制，以期为该方更好的应用于临床打下坚实的基础，同时也为VaD的防治提供新靶点和新方法。

血管性痴呆（VaD）目前尚无确切有效的治疗方法。突触的可塑性是学习与记忆的关键分子机制，也是目前最被关注的热点研究领域之一。研究表明，抑制Rho/ROCK通路是恢复突触重塑的重要途径。本课题前期研究证实温肺降浊方对VaD疗效显著，能抑制Nogo-A蛋白表达，而该蛋白能激活Rho/ROCK通路。因此我们假说该方可能通过抑制Rho/ROCK通路而促进神经元突触再生，保护脑神经元。课题组采用双侧结扎颈总动脉制备大鼠VaD模型，采用RNAi干扰技术与中药共干预机制，并通过应RT-PCR、Westernblot、免疫组化等技术，对比观察温肺降浊方治疗前后的行为学变化及对Rho/ROCK信号转导通路相关基因Nogo-A、NgR、RhoA、ROCKⅡ、MLC、MLCP、PIIa在大鼠海马区表达的变化。探索VaD的可能发病机制和温肺降浊方靶向Rho/ROCK信号通路保护突触的分子机理。实验研究发现，大鼠脑缺血损伤后Rho/ROCK信号转导通路相关基因表达水平增加，VaD大鼠学习记忆能力能力下降，脑组织病理学损伤加重。而RNAi干扰技术与中药共干预后发现，温肺降浊方可降低Nogo-A和NgR mRNA及蛋白表达含量，最终抑制MLC及MLCP的表达，对神经损伤起到保护作用；并证实了其机制可能与该方抑制ROCKⅡ介导的Rho/ROCK信号转导通路有关。综上所述，我们得出结论：温肺降浊方治疗VaD的效应机制可能与其减少ROCK2的表达，进而抑制RhoA/ROCK2信号通路的传导，导致下游MLC、MLCP蛋白的表达水平降低而发挥神经保护的作用；另外，我们的临床观察也显示温肺降浊方可明显改善VaD患者临床效果确切。这就进一步阐明了脑VaD损伤的作用机制，解释了本方干预VaD损伤的作用途径，从而为VaD损伤机制及温肺降浊方干预靶点提供了新思路及科学依据，对推动中医药发展起到积极作用，具有重要推广意义。