海南沼蛙皮肤抗菌肽的结构与功能关系及其抗菌机理研究

Amphibian skin is a morphologically, biochemically, and physiologically complex organ that fulfills a wide range of functions necessary for amphibian survival. Many bioactive substances with special molecular structure and complex function are found in amphibian skin, especially for antimicrobial peptides. Magainin, a class of antimicrobial peptide obtained from Xenopus laevis has been applyed to treat the infection in diabetic foot. Endemic amphibian are widely distributed in Hainan province, because of the special localization, environment，and climate. At present, the libiraies of bioactive proteins and peptides have been constructed from Rana guentheri skin secretion of Hainan province, in which an antimicrobial peptide has been screened and purified. The antimicrobial peptide exhibited potent antibacterial activities not only to Gram-positive bacteria, such as Staphylococcus aureus,S. Agalactiae and Bacillus subtilis, but also Gram-negative bacteria Escherich coli. The amino acid sequence of the antimicrobial peptide will be determined by RT-PCR and N-terminal amino acid analyses. The solid-phase peptide systhesis strategy will be used to obtain the original peptide and mutants which is used to detect the antimicrobial activity, especially to the drug-resistant strains in clinic. The results will elicit the relationship between structure and function of the antimicrobial peptide. The antibacterial mechanism of the antimicrobial peptide will be detected with the artificial cell membrane. The results will help us to research and develope a novel wide-spectrum antibiotic peptide.

两栖动物皮肤中含有大量分子结构特殊、功能复杂多样的生物活性物质，其中抗菌肽含量及种类尤为丰富。来自于非洲爪蟾的抗菌肽magainin的修饰物已应用于临床，用于治疗糖尿病人足部感染。海南省由于独特的地理条件，自然环境和气候条件，两栖动物资源丰富而独特。本项目选取种群数较多的沼蛙，构建其皮肤活性蛋白多肽分子资源库，目前已在其中筛选分离出一个抗菌肽。该抗菌肽对革兰氏阳性菌，如金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、枯草芽胞杆菌，及革兰氏阴性菌大肠杆菌均显示较强的抑制活性。本研究将利用RT-PCR方法，并结合N-末端氨基酸序列测定，确定其氨基酸序列。利用化学合成法合成该抗菌肽及其突变体，检测化学合成抗菌肽的抗菌活性及抗菌谱，尤其对于临床耐药菌的抗菌活性，以分析其结构和功能的关系。利用生物膜模型结合电子显微镜观察，研究其抗菌机理。该结果将为研究与开发新型广谱抗菌药物提供理论依据及基础。

抗菌肽是机体非特异性免疫的重要成员，一般由10-60个氨基酸残基组成，具有两亲性结构，多数带有正电荷，具广谱的抗菌活性。抗菌肽与易引起细菌产生耐药性的传统抗生素单一靶点的作用机制不同，它们通过所带正电荷与带负电荷的细菌细胞壁结合，再通过疏水区域与细胞膜结合，破坏细菌细胞膜的通透性，使内容物外泄，细菌死亡，这种作用机制使细菌对其不易产生耐药性。据《中国药用动物志》记载，沼蛙具有“活血止痛、续筋接骨、排脓生肌”的功效，主治跌打损伤、骨折、疮痈溃后脓多久不封口。两栖类动物是抗菌肽的丰富来源，因此本课题以海南沼蛙为研究对象，研究其皮肤中抗感染活性组分。从沼蛙皮肤中克隆出11个编码temporin和brevinin-2家族的抗菌肽基因(GeneBank登录号KU518306-518316)。用化学合成法合成temporin四个成熟抗菌肽(GHa-GHd)，对革兰氏阳性菌、阴性菌、及真菌均具有抗菌活性。其中对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、变异链球菌(Streptococcus mutans)的抑菌效果较佳，对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌也有抑菌作用。temporin抗菌肽与细菌作用时，在溶液中的无规卷曲结构当与细菌细胞膜接近时变为有序的α-螺旋，使其更易与细菌的细胞膜结合，引起细胞破裂，内容物泄露而死亡。生物被膜是细菌产生耐药性的重要因素之一，GHc与GHd较好地抑制口腔致病菌变异链球菌生物被膜初始阶段的贴附作用，对不同成熟阶段的生物被膜也有破坏作用。两者通过下调其合成胞外多糖基因(葡萄糖基转移酶)的表达而抑制胞外多糖的产生，从而干扰或破坏细菌生物被膜。研究结果为开发设计抗龋齿抗菌肽类药物提供依据。GHa具有抗金黄色葡萄球菌的活性，为进一步提高GHa抗菌活性，降低溶血活性，对其进行改造，获得三个衍生肽GHaK、GHa4K和GHa11K。衍生肽具有比GHa更高效、广谱的抗菌活性，对细菌细胞膜通透性更强。衍生肽具有较强的抑制细菌粘附作用、并破坏成熟的生物被膜。在有细菌存在时，衍生肽对细菌的选择性提高，更易于与细菌细胞结合，而具有更宽的治疗窗口。本课题研究结果为研究与开发新型广谱抗菌药物提供理论依据及基础。