东北林蛙皮肤新型抗菌肽Dybowskin-1CDYa，Dybowskin-2CDYa结构功能及抑菌机理研究

抗菌肽是广泛存在于生物界中的一类生物活性肽，多数具有广谱的抑菌活性，有的还具有抗肿瘤、抗病毒和热稳定性等特点。Dybowskin-1CDYa、Dybowskin-2CDYa是项目组前期工作从东北林蛙皮中鉴定得到的两种序列特异的新型线形抗菌肽，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有很强的抑菌活性，溶血活性显著低于环形抗菌肽。本项目将针对Dybowskin-1CDYa、Dybowskin-2CDYa的氨基酸序列，采用人工合成方法和基因工程表达技术，得到其单体，对其结构、性质、抑菌谱及其抗肿瘤和抗病毒活性进行系统研究，并采用共聚焦荧光显微镜、电镜、突变体表达等技术，研究其抑菌机理和活性结构域。本项目的研究对象为项目申请者得到的新型抗菌肽（已申报发明专利），属原创性科研工作。研究结果将为开发、设计得到功效显著、副作用低的新型肽类抗生素奠定理论基础，为治疗临床耐药菌株引起的感染性疾病提供新途径。

为高效得到高纯度的研究样品，进行了抗菌肽Dybowskin-2CDYa的基因工程表达。虽然成功地在酵母细胞中成功表达并纯化得到了目标抗菌肽，但表达含量低，纯化难度大。通过构建His-hEGF -Dybowskin-2CDYa-pET-30a(+)融合表达载体，在大肠杆菌中的融和表达，在优化的表达条件下，得到了30mg/L的高纯度融合多肽。纯化的融合多肽具有对绿脓杆菌和金黄色谱图球菌显著抑菌活性、促NIH3T3细胞增殖和迁移活性和促进小鼠皮肤烫伤动物模型的伤口愈合作用。上述研究结果表明该重组多肽具有开发成为治疗创伤和烧伤药物的良好用于前景。.　　抑菌机制研究结果表明，抗菌肽Dybowskin-2CDYa的作用靶点与多数阳离子抗菌肽一样，是细菌的细胞壁和细胞膜。生物信息学计算结果显示Dybowskin-2CDYa作用于模型膜POPC时,能够嵌入到膜的内部较深部位。透射电镜研究显示，dybowskin-2CDYa作用金黄色葡萄球菌40分钟后，菌体细胞表面显现出锯齿样结构，2小时候后菌体细胞表面结构脱落，内部结构遮光性与对照组差异显著，菌体死亡。.　　生物信息学分析表明，Dybowskin-2CDYa不稳定系数为52.19。我们对其进行优化改造，改造后的抗菌肽命名为AWRK6，稳定系数显著降低。抑菌实验结果显示， AWRK6的大肠杆菌的抑菌活性提高50%。.　　为实现优化得到的抗菌肽AWRK6在饲料中的应用，以替代饲料中的抗生素，将其基因序列和GST标签序列连接枯草芽孢杆菌蔗糖诱导元件SacR，构建重组表达载体pHY/SGR，转化枯草芽孢杆菌WB600。表达产物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌具有显著的抑菌活性，能有效提高鸡雏生长的肉料比，增加鸡雏的生长率，鸡雏的免疫指标γ-IFN、SIg以及IL-2显著提高。相关研究结果为抗菌肽AWRK6在饲料中的应用奠定了基础。.　　Dybowskin-2CDYa、AWRK6作用小鼠胰岛β细胞系MIN6，具有高糖保护作用，胰岛素分泌量增加0.68-1.57ng/ml，基因扩增量增加0.3-3.17 ct，降低因高糖毒性导致的细胞凋亡率，增强细胞分裂活性。其促胰岛细胞MIN6释放胰岛素并未引起质膜透性改变。AWRK6还具有降低二型糖尿病动物模型大鼠的血糖功能，对正常大鼠血糖无影响，其促胰岛素分泌机制涉及细胞内钙离子浓度增加。