红曲菌γ-氨基丁酸代谢相关基因（gabaX）的克隆、鉴定和功能分析

对我国红曲菌资源多样性进行调查，用HPLC分析测定各地收集的386株红曲菌γ-氨基丁酸（GABA）含量，经筛选获一GABA产量达10 g/L以上的Mr-5菌株。以该菌株为受体进行农杆菌介导的转化获一定量的T-DNA标签库。筛选与GABA产量相关的突变体，采用TAIL-PCR等方法克隆GABA产量相关的基因（命名为gabaX），测序后通过信息生物学比较分析相关真菌（啤酒酵母菌、构巢曲霉、烟曲霉、米曲霉等）gabaX序列的同源性，预测其保守序列、可能的功能及相关信息。构建基因缺失突变体、基因恢复突变体和插入突变体验证gabaX基因的功能；构建gabaX-GFP融合表达载体，用激光共聚焦对gabaX基因进行定位和时空表达分析。本项目研究目标是克隆3～5个新的红曲菌GABA代谢相关的基因，并对其功能和时空表达动态进行分析，以期实现从基因水平上对GABA产量进行调控。

红曲菌（Monascus）是一种重要的微生物资源，在生长过程中能产生γ-氨基丁酸（GABA）、红曲色素等多种生理活性物质。. 本项目以实验室筛选的红色红曲菌（Monascus ruber）Mr-5专利菌株为实验材料，建立了根癌农杆菌介导红色红曲菌的高效转化体系；通过PCR鉴定和遗传稳定性分析等，成功构建了含有5300多个红色红曲菌转化子的T-DNA插入突变体库；分析了代表性转化子的菌落形态、显微形态、主要代谢产物分析如GABA、红曲色价、Monacolin K、桔霉素含量等的变化，筛选获得了40株GABA含量变化较大的转化子。. 采用TAIL-PCR技术克隆获得了假定蛋白基因、细胞色素C 过氧化物酶基因等。假定蛋白基因大小为526 bp，与构巢曲霉（Aspergillus nidulans）FGSC A4的假定蛋白AN7090.2有98%相似性。采用RACE和降落PCR（Touchdown PCR）等技术克隆获得了谷氨酸脱羧酶（GAD）基因和γ-氨基丁酸转氨酶（GABA-T）基因，在红曲菌中首次克隆到GAD和GABA-T基因。. GAD基因cDNA序列全长为1784 bp，包含一个1536 bp的编码GAD基因的开发阅读框（ORF），152 bp的5’-UTR序列和96 bp的3’-UTR序列；起始密码子为ATG，终止密码子为TAA，编码511个氨基酸；理论分子量和等电点（PI）分别为57789.7 Da和6.05，催化位点为赖氨酸（Lys，K），结合位点由8个氨基酸构成；与黑曲霉（A. niger）的相似性约为80%。. GABA-T基因cDNA序列全长为1563 bp，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA，编码520个氨基酸；理论分子量和等电点（PI）分别为57534.9 Da和9.12，催化位点为赖氨酸（Lys，K），结合位点由8个氨基酸构成。与黑曲霉（A. niger）的相似性约为82%。. 利用qRT-PCR技术检测了不同培养时间Mr-5菌株的GAD和GABA-T基因的相对表达情况；对GAD基因进行了大肠杆菌原核表达和催化活性分析。. 项目实施期申请国家发明专利3件，其中2件已授权；发表研究论文15篇，其中SCI收录论文3篇；培养硕士生4名。