红曲霉高密度萃取发酵色素代谢与分泌行为研究

Monascus pigments are natural pigments produced by Monascus Spp., which have a huge market potential. Monascus pigments and citrinin are biosynthetic products in the secondary metabolism phase of Monascus fermentation. Some problems still exist in the Monascus fermentation, such as low color value, low color tune, low fermentation level and excessive citrinin. In present study, the cloud point system with excellent biocompatibility will be screened and high cell-density fermentation in two-phase aqueous system will be established. First, the relationship between cell physiology, morphology and metabolic behavior should be examined carefully. Based on those results, the secondary metabolism and secretion of pigments in the two-phase aqueous system will be studied. Second, the distribution of Monascus pigment during the fermentation process will be studied by investigating the impact factors on the partitioning of pigments and citrinin between the intracellular and the extracellular environments. Through adjustment of the enzyme activity and elimination of the inhibition of metabolites in the high cell-density fermentation, high cell-density accumulation and secretion of Monascus pigments should be achieved. This research project provides a novel tool of high cell-density for extractive microbial fermentation in two-phase aqueous system, which fulfills the blank of extractive fermentation of small molecules in the cloud point system. It also provides a classic example for microbial fermentation production of Monascus pigments, as well as other non-water-soluble products.

红曲色素是由红曲霉菌所产生的一种天然色素，市场潜力巨大。它与桔霉素毒素源于红曲霉菌发酵过程的同一代谢途径，目前仍存在发酵水平偏低、色价偏低、色调偏低和桔霉素含量容易超标等问题。本课题拟筛选具有良好生物相容性的浊点萃取发酵系统，建立高细胞密度两相发酵体系。通过分析高细胞密度萃取发酵系统内细胞生理、形态及代谢与分泌行为的关系，研究该发酵系统中红曲霉的代谢行为及色素分泌机制；其次通过研究该双相发酵系统中红曲色素与桔霉素的胞内积累与胞外分泌行为，阐明发酵过程中红曲色素及桔霉素在胞内和胞外的分配规律。在此基础上通过调节关键酶活及控制代谢抑制物，提高红曲色素高密度萃取发酵过程代谢水平和质量。本项目探索出一条红曲色素在两相分配系统中高细胞密度萃取发酵新途径，填补了小分子物质在浊点系统中萃取发酵的空白，并为红曲色素以及其它微生物非水溶性产物的发酵生产和研究提供理论参考。

红曲色素是红曲霉菌发酵代谢的一种天然食用色素，已被广泛应用并具有很大的市场潜力。本研究是采用萃取发酵技术，解决传统发酵胞内色素积累造成的产生抑制等问题，同时结合高细胞密度发酵技术高产红曲色素。研究筛选了2株与萃取培养基生物相容性好的红曲霉菌株（Monascus anka GIM 3.592和Monascus ruber CGMCC 10910）。萃取发酵过程中表面活性剂通过破坏红曲霉细胞壁，增加细胞膜渗透性和通透性，进而促进胞内色素的快速跨膜转运，有利于分泌；跨膜过程中色素的类型将发生转化。红曲色素中黄、橙、红三种色素的比例及色调可以采用发酵pH和氮源实现调控，低pH（小于2.5）可消除桔霉素积累。.高密度萃取发酵的细胞密度与营养因素密切关系，但与红曲色素产率成反比，菌体生长与色素代谢呈现出非偶联关系，因此需要控制适宜的细胞浓度。萃取发酵过程中细胞形态（菌丝直径和菌球大小）与胞内外色素代谢存在一定的内在关系，菌丝直径可以作为萃取发酵过程中色素代谢的参考标准；通过高密度发酵可以获得高达40 g/L的细胞密度和200 AU/mL的黄色素含量；高密度连续萃取发酵可以及时带走萃取的胞外色素，避免积累抑制，促进胞内色素分泌；固定化连续萃取发酵具有相同的作用；萃取发酵产生的胞外色素，除了产4种已知色素（monascin，ankaflavin，rubropunctatin，monascorubrin）外，还产生4种新结构的黄色素，在430 nm有最大吸收值。色素的提取及分析过程中，溶剂pH是一个关键参数，必须控制在小于或等于2.5，避免色素光谱改变及红曲橙色素与氨基化合物的亲氨反应，确保红曲色素的分析准确。采用微乳液萃取结合大孔树脂吸附分离的方法实现了红曲色素与非离子表面活性剂的分离。.胞内色素含量与油脂含量存在一定的正相关关系，萃取发酵过程中，胞内色素会被萃取到胞外，而油脂则一直存在于胞内，使得代谢流流向色素合成的方向。另外，高糖发酵可促进黄色素合成相关基因mppE基因的表达，促进黄色素分泌，从而提高胞内外黄色素产量，总量可高达400 AU/mL。.本研究充实高密度发酵和萃取发酵理论，填补小分子物质在萃取系统中萃取发酵的空白，为红曲色素以及其它微生物非水溶性产物的发酵生产提供理论参考。