布鲁氏菌感染巨噬细胞诱导的自噬抑制细胞凋亡的分子机制研究

Apoptosis is the inmmune protection mechanism of macrophages after the infection of pathogens.However,Brucella can inhibit the apoptosis of macrophages to avoid the killing of the host cells.Our previous researh has proved that autophagy favors Brucella Melitensis Survival in infected Macrophages and the autophagy pathway is regulated by the mTORC1 signaling pathway which can inhibit the apoptosis of macrophages.However， the mechanism of the inhibition is not clear.Our future work is to screen and identify the signaling proteins which is presumed to be invovled in the inhibition.This research could reveal the pathogenesis of Brucella and provide a theoretical basis for the prevention and treatment of brucellosis.

被病原微生物感染后巨噬细胞发生凋亡是宿主的一种免疫保护机制，然而，布鲁氏菌可以抑制宿主细胞凋亡以逃脱巨噬细胞的杀伤作用并在巨噬细胞内长期存活。我们前期的研究工作发现：16M诱导巨噬细胞产生的自噬有利于16M在巨噬细胞内生存繁殖，而且该自噬途径受mTORC1负调控，并且具有抑制细胞凋亡的作用,然而，其具体机制尚不清楚。本研究在前期已有的工作基础上，通过qRT-PCR、RNA干扰、Weston-blotting等技术筛选羊种布鲁氏菌侵染巨噬细胞早期，mTOR信号通路中抑制细胞凋亡的信号分子，并验证这些信号分子在布鲁氏菌感染巨噬细胞模型中是否具有调控自噬以抑制细胞凋亡的作用。进一步揭示布鲁氏菌胞内寄生机制，为布鲁氏菌病的防控提供理论基础。

布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌引发的一种人畜共患传染病。布鲁氏菌能够抑制细胞的凋亡和促进细胞的自噬，导致布鲁氏菌在吞噬细胞中生存繁殖，已有研究表明PI3K/Akt信号通路不仅参与细胞凋亡、自噬等多种细胞活动和生物学效应还与病原体在细胞内的生存繁殖密切相关，然而，该信号通路否参与了布鲁氏菌在宿主细胞内的生存繁殖尚鲜有报道..目的：本研究通过探讨PI3K/Akt信号通路对胞内布鲁氏菌生存繁殖的影响及与布鲁氏菌介导的细胞凋亡、自噬的影响，揭示布鲁氏菌在巨噬细胞内持续性感染的分子机制，为布鲁氏菌病新药物研发、防治及家畜抗病育种工作奠定基础。.方法：（1）应用Western blot技术检测：布鲁氏菌16M（16M）、其它菌株和脂多糖LPS对巨噬细胞内p-Akt(S473)和p-Akt(T308)表达的影响（2）抑制剂LY（LY）与巨噬细胞孵育1h，然后，用16M侵染巨噬细胞，未经抑制剂LY处理的细胞作为对照组，分别在30min、45min、4h、12h和24h 检测布鲁氏菌的CFU；用ELISA检测细胞上清液中IFN-γ、IL-12p70和TNF-α的分泌。选取6-8周龄雌性BALB/c小白鼠（每组10只），腹腔注射抑制剂LY（20mg/kg/day）并持续到实验结束，给药5天后感染16M，剂量为LD100(4.6×108CFU/0.2mL)和LD50(6.3×107CFU/0.2mL)，统计小鼠的死亡率；感染1×106CFU/0.2mL剂量的16M，取小鼠脾脏和肝脏，计算16M的含量；利用病理切片技术，观察病理变化。（3）抑制剂LY与巨噬细胞作用1h，然后，用16M侵染巨噬细胞，未经抑制剂LY处理的细胞作为对照组，利用caspase-3、8、9 活性检测试剂盒检测其活性变化；利用实时定量PCR和Western blot检测凋亡相关基因的表达；利用流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。（4）用慢病毒包装Plex-MSC-EGFP-LC3质粒，转染巨噬细胞，抑制剂LY与转染的巨噬细胞作用1h，然后用16M感染细胞，在12h和24h，用共聚焦显微镜检查EGFP-LC3绿色聚点，及溶酶体与EGFP-LC3绿色聚点的共定位；利用投射电镜观察细胞中包含16M的自噬泡的数量。（5）对p110α基因设计四条特异性阳性siRNA分子和一条阴性siRNA分子，构建shRNA慢病毒表