温和灸联合间充质干细胞移植对肛门括约肌损伤结构和功能的影响

Fecal incontinence(FI) referred to inability to hold solid or liquid stool. It is a refractory diseases and seriously affect the patiences’ quality of life . One of the major causes of anal incontinence is the injury of the anal sphincter..On the basis of homing mechanism of warm-moxibustion and mesenchymal stem cell(MSC) therapy for sphincter injury,the study is to investigate the influnce of combination of mid-moxibustion and MSC therapy on the structure and the function of anal sphincter repair..Myoelectricity and resting pressure of anal sphincter are measured to evaluate the anal function.Wound repair is observed by HE and Masson stain and differentiation assay of MSC is by immunofluorescence. Cytology and molecular biology techniques,such as Gene Array and Real time PCR,are used to detect αsmooth muscle actin,Myogenin,Desmin for anal sphinctr wound repair.It has important significance for exploring the biological therapy of combining traditional Chinese and Western medicine and the treatment of fecal incontinence.

大便失禁是指各种原因引起的不能随意控制液体和固体粪便排出，严重影响患者生活质量，肛门括约肌损伤是导致肛门失禁的主要原因之一。在应用温和灸l联合间充质质干细胞治疗括约肌损伤归巢机制研究的基础上，进一步研究通过不同温和灸治疗时间联合干细胞移植，对肛门括约肌功能及肌肉修复的作用。采用测定括约肌肌电、静息压及最高收缩压的生理实验方法，进行肛门功能评定。通过HE、Masson组织染色，观察组织修复，通过检测α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、肌生成素(Myogenin，F5D)、结蛋白(Desmin)表达，共聚焦免疫荧光显微镜观察GFP+干细胞，分析干细胞定植及平滑肌和横纹肌分化，为探究中西医结合生物疗法与治疗大便失禁具有重要意义。

目的：本研究采用Zutshi肛门括约肌复合体损伤模型，观察不同的干细胞注射方式对创面的修复作用，进而探索温和灸联合不同方式的骨髓间充质干细胞移植对大鼠损伤肛门括约肌的结构和功能的影响，为临床应用提供一定的科学依据。.方法：将120只SD大鼠随机分为温和灸+局部注射组，温和灸+静脉注射组，局部注射组，静脉注射组，温和灸组（每组24只）。所有大鼠均采用Zutshi大鼠肛门括约肌复合体损伤模型，造模成功后各组均采用温和灸15min或GFP阳性的骨髓间充质干细胞移植（局部、尾静脉）进行治疗，连续治疗7天。分别于术后7，14，28天进行各组大鼠肛门括约肌功能性检测，即肛压（收缩压、静息压）与肌电（振幅、频率）。于术后第28天时进行肛门括约肌组织学检测（免疫荧光，Masson染色）。免疫荧光（α-SMA或Desmin）定位大鼠括约肌创面GFP阳性BMSC；Masson染色定量比较各组间新生肌肉组织与胶原纤维的含量。.结果：1. 在造模后第28天时，温和灸+局部BMSC组新生肌纤维含量显著高于其他组（P<0.05），而局部BMSC组与温和灸+局部BMSC组的胶原纤维含量均低于其他组，但两者之间没有显著差异（P>0.05）。2. 在造模后第28天时，温和灸+局部BMSC组创面GFP荧光强度最强，提示有更多的BMSCs在创面定植，但未发现荧光共定位。.3. 在术后7、14天，温和灸+局部BMSC组的静息压显著高于温和灸+静脉BMSC组、静脉BMSC组及温和灸组（P<0.05）；温和灸+局部BMSC组与局部BMSC组的关于静息压的差异直到术后28天才具有统计意义（P<0.05）。在术后14、28天，温和灸+局部BMSC组收缩压显著高于其他组（P<0.05）。4. 在术后7天时，各组EMG振幅与频率均无显著差异。术后14天，两组局部BMSC组的振幅均显著高于其他组（P<0.05），但两者之间没有显著差异。而温和灸+局部注射BMSC组频率也较其他组显著增高（P<0.05）；直到术后28天，温和灸+局部BMSC组振幅才显著高于局部BMSC组（P<0.05）。.结论：本实验通过研究温和灸与不同骨髓间充质干细胞注射方式的联合应用治疗大鼠括约肌损伤模型，发现温和灸15min联合局部注射BMSC可显著促进大鼠括约肌与血管新生，并能够加速肛压与括约肌肌电的恢复。温和灸与局部注射BMSC联合局部注射