使用基因修饰的三相结构蚕丝支架重建组织工程化前交叉韧带-骨止点的研究

膝关节是人体主要的承重关节，而前交叉韧带（ACL）是维持其稳定的重要结构。由于ACL再生能力有限，损伤后必须通过韧带移植进行修复。而自体或异体韧带来源有限，人工韧带又非生物重建，远期效果不佳。因此使用组织工程化韧带进行生物重建是发展方向，其中韧带-骨止点的修复尤为重要。申请人在使用单相结构蚕丝支架重建ACL过程中发现不能再生韧带-骨直接止点（胶原纤维、纤维软骨、钙化纤维软骨和骨四层结构），而形成间接止点（胶原纤维和骨二层结构），导致应力集中，重建失败。因此，本研究以构建三相结构支架为切入点，在支架上分别形成有利于韧带、软骨和骨组织再生的结构区，在不同结构区使用目的基因修饰。接种在支架上的骨髓基质干细胞经固化在不同结构区的目的基因转染后分别向韧带、软骨和骨方向分化，植入体内后有望再生韧带-骨直接止点。本研究将有助于提高复合组织的再生构建技术，从而优化组织工程韧带的临床治疗方法，提高疗效。

组织工程韧带的大量临床前研究表明再生韧带与骨性隧道之间的愈合是影响韧带重建疗效的主要因素。目前单相结构（即单一结构）的韧带支架很难在骨道中再生出典型的韧带—骨接合部四层结构（胶原纤维、纤维软骨、钙化纤维软骨和骨），多数情况下形成韧带胶原纤维与骨组织的直接连接。韧带和骨这两种力学性质截然不同的组织直接连接导致交界面的应力集中，造成固定失败。本研究构建了具有三相结构的新型仿生蚕丝支架，其复合结构分别有利于韧带、软骨和骨的再生。在三相结构表面进行基因修饰，其可转染在支架上进行外扩增的基质干细胞，诱导细胞分别向韧带、软骨和骨的方向分化，从而成功构建韧带-骨接合部，加快组织工程韧带在骨道中的愈合。本研究发现 1）制备的三相蚕丝编织韧带支架表面微孔结构良好，微孔互相交通，孔径适宜，有利于种子细胞粘附、增殖；其力学强度和刚度与正常兔韧带的力学性质类似，能够满足兔ACL重建的要求；2）成功制备搭载了BMP-2（Lenti2BMP）和TGF-beta（Lenti2TGF）的慢病毒，两种慢病毒成功固化在三相蚕丝韧带支架材料的骨区和软骨区，能够成功转染MSCs。western blot显示：骨区分泌的BMP-2明显增多，软骨区分泌的TGF-beta和II型胶原明显增多。RT-PCR显示骨区MSCs的BMP-2的表达量和软骨区的TGF-beta的表达量明显增高；3）应用病毒修饰三相仿生生物支架重建兔前交叉韧带，发现在第8，16和24周时骨区的成骨量明显高于对照组，软骨区的II型胶原分泌明显高于对照组，同时实验组的拔出力明显高于对照组。本研究成功的模拟了正常韧带-骨界面的梯度结构，有效提高了人工韧带-骨交界面的拔出力。