Scleraxis基因修饰骨髓间充质干细胞促进重建前交叉韧带愈合的实验研究

前交叉韧带（ACL）损伤是运动创伤领域多发病，研究显示韧带重建术并不能完全恢复患者功能，ACL重建术后要取得最好效果，移植物的韧带化转归至为关键。根据肌腱韧带发育理论和项目主持人的前期实验结果，本研究运用基因治疗和组织工程等学科的基础知识和方法，从国际前沿领域探索如何定向诱导骨髓间充质干细胞（BMSCs）韧带系分化，探讨提高ACL移植物韧带化转归的深层次理论与应用基础问题。首先借助非病毒载体FuGene HD携带Scleraxis基因转染鼠BMSCs，体外不同培养条件下观察BMSCs韧带系分化的作用及机制；同时观察过表达Scleraxis的BMSCs在植入鼠ACL重建移植物后不同时期的生物学变化过程，并评价其体内韧带系分化和促进移植物转归的能力。本研究深入探讨Scleraxis基因对BMSCs韧带系分化作用及机制，探索促进ACL移植物转归的新方法，为临床研究奠定理论基础。

前交叉韧带（ACL）损伤后韧带重建术并不能完全恢复患者功能，Scleraxis(Scx)基因是肌腱和韧带特异性分子标志，与肌腱、韧带发育和再生有关, 骨髓间充质干细胞（BMSCs）具多向分化潜能，可分化为软骨、骨及韧带等特征，可促进新生韧带-骨界面的愈合。本项目采用非病毒载体FuGene HD携带Scx基因转染鼠BMSCs，体外不同培养条件下，观察BMSCs韧带系分化的作用及机制；同时观察过表达Scx的BMSCs在植入鼠ACL重建移植物后不同时期的生物学变化过程。本项目的主要内容及重要结果：（1）体外细胞免疫荧光染色显示3、7、14天三组I 型胶原、III型胶原、X型胶原和Scx呈高表达，II型胶原表达弱。 RealTime-PCR结果显示韧带相关基因、软骨发育3个特征基因三实验组表达量较对照组增高（P<0.05），其中力学组基因表达量高于基因组和共培养组（P<0.05）。骨发育2个特征基因的表达与对照组相比无变化（P>0.05）。激光共聚焦显微镜结果显示:与对照组相比，三个实验组促进F-actin的聚合,使F-actin的密度升高，并沿着细胞长轴方向排列。（2）体内实验Micro-CT 扫描ACL重建膝关节，术后4周，实验组移植物骨密度、骨小梁数目较对照组增加（P<0.05），骨小梁间隙较对照组较小（P<0.05）。术后12周，实验组移植物骨密度、骨小梁数目较对照组增加（P<0.05），细胞组骨密度、骨小梁数目小于基因组（P<0.05）。（3）生物力学测试证明，二实验组术后12周和24周移植物的极限载荷和刚度明显较对照组增强（P<0.05），12、24周细胞组极限载荷和刚度小于基因组（P<0.05）。（4）HE染色显示：术后2周移植物中心坏死，但表面被覆宿主细胞，实验组进入供体的细胞最多。术后12周，宿主细胞进一步进入移植物，但对照组移植物中心仍可见坏死组织。术后24周，基因组骨隧道形成类似于韧带-纤维软骨-钙化软骨-骨的直接止点结构，细胞组和对照组骨髓道韧带与骨止点间形成大量有序排列的胶原纤维，形成间接止点结构。结果表明：Scx基因体外可以促进BMSCs韧带系分化，合并力学刺激效果更好，Scx基因体内可以促进ACL移植物的成熟，并且最终取得较好的力学性能。