绵羊α-TTP互作蛋白筛选及其主要信号转导途径研究

α-生育酚转移蛋白（α-tocopherol transfer protein，α-TTP）是决定体内α-生育酚转运和分布的重要因子。目前有关α-TTP研究主要集中于人和鼠，绵羊上未见报道。在本团队前期研究基础上（已证实绵羊体内存在α-TTP，并成功克隆其全基因），本课题采用荧光定量PCR和Western-blot技术测定不同维生素E水平下绵羊α-TTP mRNA及蛋白表达水平；构建肝脏细胞模型，采用细胞共定位和抑制剂处理方法研究绵羊α-TTP与溶酶体、ABCA1和apoA-1之间作用关系；应用酵母双杂交和免疫共沉淀技术筛选α-TTP互作蛋白；综合利用细胞共定位、过表达及表达抑制方法对筛选后的α-TTP互作蛋白进行鉴定并确定其主要信号转导途径。选题新颖，研究内容处于本领域前沿，研究结果对阐明绵羊α-TTP转运α-生育酚的主要信号转导途径及完善维生素E作用机制具有重要科学意义和参考价值。

本课题按任务书要求已完成各项内容。成功克隆出α-TTP全长基因，发现其全长序列共1098bp，编码282个氨基酸，蛋白分子量约为32.01kD，该蛋白不具有跨膜功能；α-TTP基因在绵羊心、肝、脾、肺、肾、睾丸等组织中均有表达，但在肝脏和睾丸中表达量远远高于其他组织；成功构建绵羊睾丸cDNA文库，对不同维生素E水平下绵羊睾丸差异基因进行筛选，发现差异基因参与发育过程、能量脂质代谢过程及氧化应激过程等；对睾丸抗氧化酶相关基因和生殖激素相关基因研究发现维生素E可一定程度上提高抗氧化酶基因和生殖激素相关基因的表达量；成功克隆绵羊肝脏CDS区基因并构建原核表达载体；通过人工合成多肽抗原结合淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术成功制备绵羊α-TTP单克隆抗体，并利用免疫组织化学技术对α-TTP在绵羊肝脏中定位进行观察，发现其主要定位于肝脏细胞胞质中；α-TTP同胞内位置转移相关基因以及蛋白酶体基因有关且受日粮VE水平影响，不同处理组间RTP4、CENPE、GOLGA4、BNIP3和PSMC2基因差异表达量均在2倍以上，表明这些基因可能在α-TTP转运维生素E过程中发挥着重要作用；而日粮维生素E水平显著提高绵羊肝脏α-TTP蛋白表达量；利用基因芯片技术和免疫共沉淀联合质谱分析技术对α-TTP互作基因和互作蛋白进行了筛选，构建人α-TTP真核表达载体并在HepG2细胞中表达后引发表达水平发生改变的基因探针数323个；筛选出10个与α-TTP相互作用的候选蛋白，这些互作蛋白主要是与转运、能量代谢、基因表达调控和应激相关的蛋白；筛选出的差异基因涉及PPAR信号通路、MAPK信号通路以及脂质代谢相关基因、糖类代谢相关基因和氧化相关基因。. 研究结果说明维生素E可能通过调节机体氧化水平、影响转录因子活性、影响同细胞粘附、细胞凋亡、细胞炎症相关的基因来调控α-TTP的表达水平；该结果部分揭示了绵羊α-TTP转运生育酚的关键因子及维生素E调控α-TTP表达的作用机制，并为研究α-TTP的生理功能及其转运维生素E的作用机制提供了理论依据。