基于CML新型特异性肿瘤抗原及抗体制备CAR-T细胞靶向治疗CML的实验研究

The application of TKI for CML treatment greatly promoted therapeutic outcome. However, TKI can only inhibit Bcr-Abl kinase activity, it cannot eradicate CML cells. Thus, CML patients eventually relapse or revolve to blast crisis phase. The promised CAR-T therapy is expected to address the problem of CML treatment. The core of CAR-T therapy is to identify a specific target on the surface of tumor cells and to prepare corresponding antibodies. In our previous study, we immunized mice with CML leukemia cells and prepared a CML specific antibody named Cam1. In this project, we plan to carry out the following four parts: (1) to determine the properties of Cam1 antibody; (2) to identify the antigen targeted by Cam1 antibody; (3) to prepare CAR-T cells targeted CML therapy based on Cam1 antibody; (4) to explain the role of Cam1 targeted antigen in CML and the relationship between Cam1 targeted antigen and Bcr-Abl. The significances of this research include: (1) the identification of TSA on CML cell surface can provide basis for CML diagnosis, therapeutic monitoring and prognosis judgement; (2) the preparation of CAR-T cells targeting CML can lay the foundation for CML cell immunotherapy, and provide new therapeutic options for recurrence and blast CML patients; (3) to clarify the role of Cam1 targeted antigen in CML and the mechanism of its specific expression in CML cells.

TKI用于CML治疗取得了显著疗效，但TKI只能抑制Bcr-Abl激酶活性，不能根除CML细胞，导致病人复发或急变。目前兴起的CAR-T疗法有望解决CML治疗困境。CAR-T疗法最重要的是鉴定特异的肿瘤细胞表面分子靶标及制备相应抗体。我们将CML患者的白血病细胞免疫小鼠，制备了一个CML特异抗体Cam1。本项目继续开展以下四方面研究：（1）确定Cam1抗体特性；（2）鉴定Cam1抗体靶向的抗原；（3）基于Cam1抗体制备CAR-T细胞靶向治疗CML；（4）阐明抗原在CML中的作用及与Bcr-Abl的关系。本课题的研究意义包括：（1）寻找CML细胞表面的TSA，为CML诊断、疗效监测及预后判断提供靶标；（2）制备靶向CML的CAR-T细胞，为CML细胞免疫治疗奠定基础，为复发及急变的CML患者提供新的治疗选择；（3）明确Cam1抗原在CML中发挥的作用，阐明其特异性表达于CML细胞中的机制。

酪氨酸激酶抑制剂治疗慢性髓细胞白血病(CML)取得了显著疗效，但它不能根除bcr-abl基因，复发和耐药仍是该病治疗的瓶颈。免疫治疗通过特异性靶向肿瘤细胞和提高机体免疫功能，是唯一可治愈肿瘤的方法。本项目研究了两种CML免疫治疗新策略。①分子靶标选择是免疫疗法的关键。BCR-ABL是CML的肿瘤特异性抗原，其抗原特异性限制在融合位点附近。但BCR-ABL定位于胞质，无法被胞外抗体直接识别，导致CML免疫治疗受限。本研究利用BCR-ABL经蛋白酶体降解成多肽与HLA分子结合，以SSKALQRPV/HLA-A2复合物被呈递至细胞膜表面，实现胞内抗原膜表面化。分别选择SSKALQRPV/HLA-A2和CML细胞潜在膜抗原为CML治疗靶点，获得了特异性IgM抗体11D8及其序列，经体内外实验证实了其对CML细胞的抑制作用。研究结果为后续CML中11D8抗体作用机制探讨，CML其他潜在靶抗原鉴定及基于CML特异性抗体的其它免疫治疗策略的发展奠定了基础。② 嵌合抗原受体（CAR）疗法因高特异性及肿瘤细胞杀伤效应等优势是癌症治疗的重要手段。白血病干细胞（LSC）是导致复发的重要原因，由于膜表面抗原CD26在CML-LSC高表达，基于CD26-CAR细胞疗法可解决CML治疗困境。我们先后尝试了CAR-T、CAR-NK及CAR-M疗法。将CD26-CAR慢病毒感染T细胞后，CD26-CAR-T细胞相互杀伤。CAR-NK遇到NK细胞难以被病毒感染的问题，最后锁定在CAR-M疗法上。巨噬细胞作为先天性免疫的效应细胞，具有强大吞噬能力和高效抗原提呈作用，可激活继发性抗肿瘤免疫。与T细胞及NK细胞相比，巨噬细胞在免疫抑制性微环境中更易浸润肿瘤，为肿瘤免疫治疗提供新机会。我们构建了CAR-M，并检测了其体外靶向CML细胞的吞噬效果，将进一步验证其在动物体内效果。该研究将为CML细胞免疫治疗提供新思路。