新型CML特异性CTL应答诱导策略：CTP介导外源性BCR-ABL增强抗原交叉递呈及 DC疫苗研究

BCR-ABL fusion protein is a leukemia-associated antigen that is indispensable for CML cell survival, and is thus an ideal target antigen for DC vaccine against CML. While cross-presentation of exogenous leukemia-associated antigen in DC is key to the induction of leukemia-specific CTL response, the present antigen-loading system can’t efficiently activate the cross-presentation potential of DC, resulting in limited efficacy of DC vaccine in anti-leukemia therapy. Cytoplasmic transduction peptide (CTP), a transduction peptide with highly-efficient transduction potential and significant cytoplasmic localization preference, can accomplish the “internalization” of exogenous antigens through its preference of cytoplasmic localization. The “internalization” of the exogenous antigen is a prerequisite for the activation of cross-presentation potential. Therefore, we put forward the research assumption of “inducing CML-specific CTL response via the accomplishment of cross-presentation of exogenous BCR-ABL antigen with CTP”. Through prokaryotic expression and purification of the CTP-BCR-ABL fusion protein, we intend to observe its transduction activity, subcellular localization and cross-presentation in DC, and the in vitro and in vivo BCR-ABL-specific CTL response activated by the DC vaccine. This novel DC-based strategy of “activating the CML-specific CTL response via the accomplishment of cross-presentation of exogenous BCR-ABL antigen through CTP” shows great advantages in good biological safety, efficient activation of the cross-presentation potential of DC, and ideal target antigen.

BCR-ABL融合蛋白是CML细胞性特异抗原，也是CML DC疫苗的理想靶抗原。外源性白血病相关抗原在DC细胞内交叉递呈是诱导白血病特异性CTL应答的关键，但现有抗原负载系统不能有效激活DC细胞交叉递呈潜能，限制了DC疫苗抗白血病效能。胞质转导肽（CTP）具高效转导潜能和显著胞质定位特性，可将外源性抗原定位于胞质而实现“内源化”，而外源性抗原“内源化”是激活递呈潜能的前提。故我们提出“借CTP实现外源性BCR-ABL抗原交叉递呈以诱导CML特异性CTL应答”设想。拟通过表达纯化CTP-BCR-ABL融合蛋白并将其转入DC细胞，观察其在胞内的转导活性、亚细胞定位、交叉抗原递呈水平及其在体内外激活BCR-ABL特异性CTL应答的效应。本研究首次以DC细胞为基础，借CTP实现外源性BCR-ABL抗原交叉递呈，激活CML特异性CTL应答，有生物安全性好、靶抗原理想和增强DC细胞交叉递呈潜能等优势。

慢性粒细胞白血病（CML）以酪氨酸激酶活性的BCR-ABL蛋白持续表达为主要特征。目前，针对BCR-ABL酪氨酸激酶活性的特异性小分子抑制剂使CML的治疗取得了很大的进展，但不能清除CML恶性克隆且部分患者出现耐药或复发。因此，急需进一步探讨CML治疗新策略。. BCR-ABL融合蛋白可作为CML的特异性抗原，是非常理想的免疫学靶标。我们人工合成胞质转导肽（CTP）融合抗原多肽，使抗原多肽在CTP的介导下直接穿透树突状细胞（DC）胞膜定位于胞质——全新的抗原负载系统刺激DC，通过激活交叉抗原途径经由MHC I类分子递呈而诱导CML特异性的免疫应答。. 我们用GM-CSF、IL-4诱导Balb/c小鼠骨髓细胞分化形成DC，通过流式细胞术检测其特异性表面分子表达，其中CD11c表达75.5%，CD86表达42.5%，MHC I类分子表达93.3%，MHC II类分子表达23.5%。荧光实验结果显示，CTP介导的肽段转导效率在肽段浓度为10 μmol/L、转导时间30 min是最有效；且CTP介导的抗原肽段在胞质中有良好的定位效能。CTP介导的抗原负载DC与T细胞共培养后，上清液IL-2水平随着抗原浓度增加而增加，最高浓度可达230 ng/L，表明已刺激DC的抗原交叉递呈反应。CCK8实验显示实验组和对照组DC存活率无明显差异，说明CTP无细胞毒性。体外实验表明实验组活化的T细胞分泌IFNγ以及TNFα的能力明显高于对照组，Elispot板上斑点可达167个以上；且实验组T细胞在抗原的刺激下，增殖明显。T细胞活化标志CD69、CD137表达量分别达到72.9%和28.3%，明显高于对照组。晚期T细胞脱颗粒标志CD107a在实验组表达增加明显，达到68.5%。细胞杀伤实验也表现出更优于对照组的能力，在效靶比为50：1的条件下，细胞溶解效率为40%以上，表明CTP介导的抗原负载能更好的刺激CML特异性CTL免疫应答。体内实验也显示出良好的免疫治疗效应，实验组裸鼠肿瘤明显小于对照组，生存期明显延长。. 本课题为CML的治疗提供了新的思路，且约1/3的急性淋巴细胞白血病患者亦表达BCR-ABL融合蛋白，该方法对其免疫治疗亦有重要意义。大多数白血病的发生与各种融合基因有关，该抗原负载方法策略对各类型白血病免疫治疗亦有重要的指导意义。