构筑半合成金属酶：利用蛋白质二级配位环境调控金属配合物的反应与机理研究

本项目着重研究蛋白质二级配位环境对非天然金属辅酶的反应选择性的影响；通过计算机辅助模拟设计，根据蛋白质配体的结构，选择与之相"匹配"的非金属辅酶，并合成一系列新型半合成金属酶。通过调节蛋白质配体的二级配位环境（如氢键，疏水作用等）和空间位阻来调控金属中间体的形成和反应性能，研究其对小分子氧源如氧气，过氧化氢等的活化；并进一步探索如何避免金属配合物的自身被氧化失活。为设计高效的氧化半合成金属酶以及理解金属氧活性物种与C=N键反应机理提供实验基础和理论依据；更加深入地探索如何通过蛋白质工程技术，用生物合成的手段获得蛋白质配体，用以研究金属配合物的新方法。

构筑半合成金属酶，研究蛋白质二级配位环境对非天然金属辅酶的反应性、选择性的影响是本研究的主要内容。通过计算机辅助模拟设计，根据蛋白质配体的结构，选择与之相“匹配”的锰卟啉金属辅酶，并合成一系列新型半合成锰酶。通过调节蛋白质配体的氢键等次级配位环境来调控金属中间体的形成和反应性能，研究其对小分子氧源如过氧化氢等的活化；探索金属配合物自身被氧化失活的过程与机理。在辅酶附近通过多个氨基酸残基突变，构筑新的配位点，络合不同的金属离子，研究第二金属对酶活性的影响。在此基础上，尝试利用锰卟啉与氯胺的反应，拓展金属酶的反应的类型，实现非天然的小分子活化过程。为设计高效的氧化半合成金属酶以及理解金属氧活性物种与O-O键断裂反应机理提供实验基础和理论依据；更加深入地探索用生物合成的手段获得蛋白质配体，研究金属配合物的新方法。.主要的研究结果为：.1）以锰卟啉为中心的半合成金属酶模型的设计、合成以及活性研究。分别设计L29H、F43H、H64F、L29H/F43H、L29H/H64F、F43H/H64F以及L29H/F43H/H64F这7种不同突变的肌红蛋白（Mb），发现蛋白质的29位、43位及64位在口袋上方，可能与底物的进入，结合，及解离等过程相关。我们认为处于64位组氨酸保持一个去质子化的状态是非常必要，而43位的组氨酸可以通过氢键的形式与过氧化氢远端O产生相互作用，促进O-O键的断裂，从而在一定程度上加快反应的进行；.2）双中心金属酶中第二金属对酶活性影响的研究。在锰卟啉为中心的半合成金属酶模型中，引入一个新的金属中心，并考察第二金属离子的引入对酶的中间体产生的影响。我们发现第二金属铜或锌的结合，在中性及较高pH条件下，金属酶活性略有增加；.3）合成金属酶与氯胺的反应。以蛋白质作为配体形成的半合成金属酶，与铵根离子和次氯酸根离子反应生成的氯胺与锰卟啉MnV≡N中间体。通过锰卟啉为模型化合物，证实了这一活性中间体的产生，并考察其与小分子的反应性。.4）多核铜的氧化酶活性位点模拟。考察CuCl2催化活化氧气氧化醇的工作中，我们得到了含有三个铜核的复合物[Cu3(μ3-OH)( μ3-Cl)]4+成功模拟了天然多核金属酶中金属簇的氧化功能。我们还发现三核铜复合物不仅对氧化反应有催化作用，对炔、环氧化合物、叠氮化合物的三组分点击反应也具有较好的催化活性。