蛋白磷酸酶PP1介导EV71病毒抑制宿主激酶IKKβ磷酸化的机制和作用

In recent years, HFMD (hand, foot and mouth disease) caused by EV71 is a serious threat to public health, to clarify its pathogenesis has become extremely urgent. To study the mechanism of interaction between EV71 and host will help elucidate its pathogenesis. We found that the 2C protein of EV71 could interact with IKKβ and inhibit IKKβ phospharylation. IKK kinases play a key pivotal role in the antiviral immune response. Our preliminary experiments confirmed the interaction of 2C protein and protein phosphatase PP1,while PP1 has dephosphorylation function. We speculate that the 2C protein inhibited IKKβ phosphorylation by recruitment of PP1. To test this hypothesis, we will confirm the interaction among 2C protein, PP1 and IKKβ; then find sites on 2C that impact interaction and activation of IKKβ phosphorylation; and site-directed mutant on corresponding sites of EV71 infectious clone. We try to determine the IKKβ immune signaling pathways and pathogenic changes caused by mutant viruses on animal and cellular level. Eventually, This study will resolve the mechanism and its role of inhibition of IKKβ phosphorylation by virus through PP1; provide a theoretical basis to clarify the pathogenesis of hand, foot and mouth disease; further the theoretical basis for the development of anti-EV71 drug.

近年来，EV71引起的手足口病严重威胁到社会公众健康，阐明其致病机理已经变得极其紧迫。研究EV71免疫逃逸机制将有助于阐明其致病机理。我们在前期实验中发现EV71病毒2C蛋白可以与IKKβ相互作用，并抑制IKKβ的磷酸化激活。而IKK激酶是启动宿主抗病毒免疫反应的关键分子，我们在预实验中又发现2C和有去磷酸化功能的蛋白磷酸酶PP1有相互作用。据此，我们推测EV71病毒2C蛋白可能通过招募PP1抑制IKKβ磷酸化而拮抗宿主的抗病毒免疫反应。本研究将解析PP1在抑制IKKβ磷酸化中所起的作用；明确2C上影响与PP1相互作用和IKKβ磷酸化的位点；在感染性克隆上进行相应位点突变；在动物和细胞水平比较突变体病毒引起的IKKβ相关免疫信号通路和病毒致病性的变化。本研究将解析病毒以PP1抑制IKKβ磷酸化的机制及其作用，为阐明手足口病的致病机理提供理论依据，进一步为研发抗EV71病毒药物奠定理论基础。

NF-κB是一种可诱导激活转录因子，参与调节了众多的生物学过程，包括机体抗病毒免疫，细胞炎症反应，以及细胞的分化和癌变等。对NF-κB信号通路的精确调控有利于机体有效发挥免疫功能来低抗病原体的入侵。近年来，人肠道病毒作为一类重要的病原体，对公共卫生安全尤其是婴幼儿的健康都构成了严重的威胁。肠道病毒对包括NF-kB信号通路在内的一系列抗病毒免疫反应的调控以实现其免疫逃逸，在病毒的有效复制和致病中都发挥着重要的作用。 我们在该项目的前期研究中已经报道并发现了EV71病毒的2C蛋白能够通过与IKKβ相互作用而抑制IKKβ的磷酸化进而抑制NF-κB的活化。但是关于2C蛋白如何通过与IKKβ作用而抑制IKKβ磷酸化的还没有阐明.在前期研究的基础上，我们利用串联亲和纯化结合核磁质谱分析鉴定出EV71感染过程中2C蛋白与蛋白磷酸酶PP1的几种异构体均存在着相互作用。同时结合生物信息学分析我们鉴定出在2C上存在着3个PP1 docking motif。 紧接着，通过免疫共沉淀和荧光共聚焦我们确认了EV71的2C蛋白与3种PP1的催化亚基均存在着相互作用。 更进一步的，我们利用定点突变，确认PP1蛋白上的PP1 docking motif确实介导了2C与PP1的相互作用，但这一结构域并不影响2C抑制IKKβ磷酸化的效应。随后，我们利用PP1 docking motif 缺失的突变体验证了2C与PP1的相互作用对于2C蛋白抑制IKKβ的磷酸化至关重要。最后，我们利用两步法免疫共沉淀证实了2C 蛋白通过招募PP1和IKKβ形成一个三元复合体。 最后，我们验证了其他3种肠道病毒（poliovirus, Coxsackie virus B3, Coxsackie virus A16）的2C蛋白均可以招募PP1与IKKβ形成三元复合体，而抑制IKKβ的磷酸化，进而抑制NF-κB的活化。综上所述， 我们发现了人肠道病毒可以通过其非结构蛋白2C上招募蛋白磷酸酶PP1和IKKβ而形成三元复合体，以此来抑制IKKβ的磷酸化和NF-κB活化， 最终实现病毒的天然免疫逃逸. 本课题在前期发现的基础上，深入阐明了EV71的2C 抑制IKKβ磷酸化和NF-κB活化的机制，解析了蛋白磷酸酶PP1在肠道病毒调控NF-κB信号通路中发挥作用，揭示了肠道病毒的2C蛋白在病毒天然免疫逃逸中扮演重要角色.