干扰素刺激蛋白Viperin在EV71神经组织感染中所起作用及其机制

Enterovirus 71 (EV71) has become the second hazards neurotoxic pathogens only to the Poliovirus. The interferon-stimulated protein Viperin play an important role in the anti-viral innate immunity. In our preliminary experiments, we found that the expression of Viperin was significantly increased, and it could suppress EV71 replication in neural cells. Accordingly, we speculate Viperin was activated by the innate immune system to suppress EV71 virus infection and to affect pathogenicity of EV71 in the central nervous system (CNS). To test this hypothesis， we will confirm tissue distribution and activation signaling pathways of Viperin protein at first. Then we try to identify antiviral functional domains and interacting proteins that are critical for the anti-viral activity of Viperin in EV71 neurological infection. Finally we will verify the impact of Viperin on EV71 pathogenicity in the CNS by means of overexpression, RNA interference, and gene-knockout. The results will provide research ideas to pathogenesis of EV71 neurological complications, and lay the theoretical foundation for the prevention and treatment of nervous system damage caused by EV71.

肠道病毒71型(EV71)已成为肠道病毒中危害仅次于脊髓灰质炎病毒的神经毒性病原体。干扰素刺激蛋白Viperin在抗病毒天然免疫中发挥重要作用。前期实验中，我们发现Viperin在EV71感染的神经细胞中表达量显著增加，并且可以抑制EV71在神经细胞内的复制。据此，我们推测Viperin可能受天然免疫系统活化后抑制EV71病毒的感染，并影响EV71病毒在中枢神经系统中的致病性。本研究将首先确认EV71神经组织感染中Viperin的表达分布和活化信号通路，找出Viperin发挥抗EV71功能的关键功能域和相互作用蛋白，然后在乳鼠感染模型上利用过量表达，RNA干扰和基因敲除等手段验证Viperin对EV71神经致病性的影响。结果将为EV71神经并发症的发病机理提供研究思路，并为预防和治疗EV71病毒引起的神经系统损伤奠定理论基础。

肠道病毒71型（EV71）是单股正义核糖核酸（RNA）病毒，属于小RNA病毒科肠道病毒属，主要在婴幼儿中引起手足口病（hand, foot, and mouth disease , HFMD），严重时导致脑膜炎和神经系统并发症。Viperin是一种重要的干扰素刺激基因（ISG），具有广泛的抗病毒作用也在天然免疫信号传导发挥重要作用。但是， viperin蛋白在宿主抵御肠道病毒感染中的作用和机制还不明确，依据项目前期的实验，我们推测Viperin 可能受天然免疫系统活化后抑制EV71 病毒的感染，并影响EV71 病毒在中枢神经系统中的致病。在研究中，我们使用EV71病毒感染神经细胞CCF-STTG1，通过转录组测序发现Viperin的mRNA水平显著上升。然而，Viperin对人肠道病毒的影响及EV71与Viperin相互作用的机制尚不清楚。在这里，我们证实了EV71诱导的Viperin在小鼠和细胞模型中的表达，并且显示在mRNA和蛋白质水平上都发生了由EV71感染引起的Viperin的上调。此外，当我们在EV71病毒感染的细胞中敲低和过表达Viperin发现该蛋白显著抑制EV71复制。有趣的是，免疫荧光共聚焦和免疫共沉淀 实验表明，Viperin与EV71 2C以及2BC蛋白存在相互作用并共定位于内质网上。为了验证Viperin与EV71 2C蛋白相互作用的关键区域，我们构建了一系列Viperin的突变体后，利用Viperin的突变体分别与EV71 2C蛋白进行免疫共沉淀实验发现Viperin的N末端50-60位氨基酸是Viperin与2C相互作用的关键区域。内源性免疫共沉淀实验进一步证实，EV71病毒感染期间Viperin分别与EV71 2C和3D蛋白存在相互作用。同时，荧光实时定量PCR和western blotting 实验发现Viperin的N末端结构域是显著抑制EV71病毒复制的关键区域。因此，我们可以得出结论：Viperin通过其N末端结构域显著抑制肠道病毒A71型的复制。该结果不仅为EV71病毒所致神经系统损害的防治奠定理论基础，而且为开发抗病毒治疗提供了潜在的靶点。