紧密连接跨膜蛋白CLDN-1在猪瘟病毒入侵与增殖过程中的分子作用机制

The membrane protein at tight junctions claudin-1 (CLDN-1) is coming into the stage as a new hotspot for the investigation of the early infection mechanisms of human diseases caused by Flaviviridae viruses. However, there is no report yet elucidating the roles of CLDN-1 in Classic Swine Fever Virus infection. In our previous studies, we found out that CLDN-1 showed inhibitory effects on the infection efficacy of CSFV in swine and PK15 cell model. To address this scientific hypothesis, eukaryotic expression constructs will be generated for the CLDN-1and E2 gene, respectively, followed by the application of GST pull-down and subcellular co-localization techniques to validate the interaction between the host CLDN-1 protein and CSFV E2 protein. The effects of siRNA knockdown and over-expression of host CLDN-1on CSFV replication will be measured by multiple in vitro assays to discover the functions CLDN-1might play during the CSFV entry process. Furthermore, we will mutate some potential key (phosphorylation) amino acid residues of CLDN-1 (Ser206) and E2 proteins(Asn116) to study how the single site mutations would affect the interaction between CLDN-1andE2protein, and thus the CSFV infection. The implementation of this project will aid in further understanding the functions the host membrane protein CLDN-1 and viral E2 protein may play in the early infection phase of CSFV.

紧密连接跨膜蛋白CLDN-1在黄病毒科成员入侵宿主过程中扮演重要角色，是近年来研究病毒入侵机制的新热点，而CLDN-1在猪瘟病毒入侵宿主过程中的作用尚无报道。课题组前期研究发现CLDN-1的表达和猪瘟病毒感染宿主效率具有相关性，猪瘟病毒在PK-15细胞中的增殖随CLDN-1表达受到抑制而同样受到抑制。本研究拟通过分子生物学、细胞生物学和转录组学研究CLDN-1与猪瘟病毒E2蛋白的相互作用；Ser206位点突变后的CLDN-1蛋白与Asn116位点突变后的E2蛋白对猪瘟病毒感染的影响，以及两个突变位点在两种蛋白相互作用中的功能。以期阐明CLDN-1在猪瘟病毒入侵与增殖过程中的作用，探明两个氨基酸位点在CLDN-1和E2蛋白相互作用中的功能以及对猪瘟病毒感染的影响，有助于为猪瘟病毒致病机制研究提供进一步的理论补充。

猪瘟在我国猪群中长期存在，尽管国家投入了大量人力、物力和财力用于该病的防控，但仍未达到预期效果；以弱毒疫苗强制免疫为主的防制措施也存在着某些弊端。因此有必要继续深入研究猪瘟病毒入侵宿主的分子机制。.本研究采用细胞生物学和分子生物学、由现象到机制相结合的方式，通过靶基因真核过表达、RNA干扰、氨基酸位点突变、Co-IP、细胞内共定位和RNA-seq等多种实验方法和技术对CLDN-1在猪瘟病毒致病过程中的作用机制逐步深入分析。通过课题研究，取得如下成果：.1.CSFV感染PK-15细胞后，在接毒后所有检测时间点claudin-1表达显著下调（P<0.05），通过siRNA knockdown技术从mRNA水平抑制PK-15细胞中claudin-1的表达后，明显促进CSFV的感染、增殖；反之，在所有时间点，过表达CLDN-1均下调了CSFV E2蛋白的表达。提示claudin-1可能以负反馈形式参与CSFV对PK-15细胞的感染过程。.2.通过免疫共沉淀实验和细胞内共定位发现：宿主蛋白CLDN-1蛋白与猪瘟病毒E2蛋白之间存在相互作用；且突变CLDN-1蛋白关健氨基酸位点Ser206以及第一个胞外环高度保守基序W30-G49-L50-W51-C54-C64会减弱claudin-1与E2蛋白的相互作用，特别是第一个胞外环高度保守基序W30-G49-L50-W51-C54-C64的突变影响最为明显。突变猪瘟病毒糖基化位点（Asn116）对claudin-1与E2蛋白的相互作用影响不明显。.3.转录组测序分析结果显示：猪瘟病毒感染可以上调PK-15细胞的MAPK信号通路，且Claudin-1的表达水平可以调控MAPK信号通路的状态。进一步使用上调的基因进行蛋白互作分析发现：有四个MAPK信号通路的蛋白得以上调并可能存在互作关系，火山图分析提示：CLDN-1的表达水平和TRAF2呈负相关。本研究获得的成果可为CSFV感染相关疾病的防制提供新思路和策略。