基于超分辨成像技术的人红细胞骨架及膜蛋白CD47特性的研究

As the indispensable oxygen-transporting cells, human erythrocytes exhibit extreme deformability and amazing stability as they are subject to huge reversible shear stress and extrusion force during millions of circulation in the body. The unique architecture of cytoskeleton is responsible for such excellent mechanical properties. Furthermore, human erythrocytes will become aged and have been known to be a definite lifespan of 120 days after which they are captured and phagocytosed by macrophages. Recent findings suggest that membrane protein CD47 may play an essential role in erythrocyte aging and clearance. Although human erythrocytes have long been recognized for more than 300 years, myriad questions about cytoskeleton organization and aging mechanism remain unclear due to the restriction of novel techniques and methods. Thus, in this proposal, based on the super-resolution microscopy, we plan to: 1) elaborate physiological properties of erythrocyte cytoskeleton organization; 2) reveal native CD47 distribution pattern, and further investigate its interactions with cytoskeleton and membrane; 3) clarify the key markers of erythrocytes aging through analyzing spatial-temporal information changes of cytoskeleton and CD47 by establishment of aging model in vitro. This study will bring new insights into treatment of cytoskeleton-associated diseases including hereditary spherocytosis, and provide helpful guidance on blood storage and transfusion.

红细胞是人体不可或缺的运氧功能细胞，具有极强的变形性和稳定性，其在体内几百万次循环过程中遭受大量的剪切力和挤压力而不破损，这一特性与其特殊的骨架系统密不可分。虽不容易破损，但人红细胞在体内会逐渐衰老，具有约120天的稳定生命周期，最终被巨噬细胞吞噬清除。目前认为膜蛋白CD47在红细胞衰老及清除过程中扮演着重要角色。人红细胞虽被认知了三百多年，但由于技术手段的限制，其特有的骨架组织模式和衰老机制仍不清楚。因此，本项目拟基于超分辨光学成像技术，深入研究人红细胞骨架系统生理组织特性；分析CD47空间分布特点，阐明其与细胞骨架、细胞质膜的关系；体外建立红细胞衰老模型，研究衰老过程中骨架蛋白和CD47时空变化特性，揭示红细胞衰老的关键指标。相关研究结果有望给治疗红细胞骨架变异相关疾病如遗传性球形红细胞增多症提供新的思考视角，也可为合理进行血液储存、输血急救提供有益的指导。

人成熟红细胞呈现特有的双凹圆饼状形态，具有极强的变形性和稳定性，保证其在机体血液循环系统中数百万次往返穿梭而不破损。虽不易破损，但人红细胞在体内只有约120天的寿命，生命末期被巨噬细胞吞噬清除，膜蛋白CD47在其衰老及被清除过程中扮演重要角色。因此，本项目发展STORM单分子定位超分辨成像技术，对人红细胞骨架和膜蛋白CD47的组织特性展开深入研究。首先基于STORM单分子定位超分辨成像，发展新的图像识别算法，揭示生理状态下人红细胞CD47密度约为72/μm2，以单倍体形式随机分布在红细胞表面。提出二抗交联法策略，定量地证明CD47在质膜上具有85%的流动性，骨架附着率为15%。基于双色STORM成像，引入互相关分析，阐明骨架上的CD47定位于骨架上ankrin复合物，而与骨架上actin复合物没有关系。体外制备衰老红细胞，发现红细胞衰老过程中CD47含量变化有限，但成簇能力下降明显，表明衰老红细胞CD47成簇能力下降可能是被巨噬细胞吞噬的关键因素，有别于传统认知衰老红细胞由于CD47含量减少导致被清除。此外，发展出“膨胀+单分子定位”超分辨成像技术（U-ExSMLM），最终成功实现了4.3倍物理膨胀，将已有的25nm分辨率单分子定位成像提升至约6nm的分子分辨率水平，发现红细胞凹区血影蛋白骨架长度大于边缘区，凹区血影蛋白骨架密度小于边缘区，直观证明红细胞双凹圆饼骨架结构存在不对称性。以上结果为分子水平探究红细胞膜骨架和CD47组织分布特性提供了新的实验方案，为理解红细胞双凹圆饼形状骨架机制和形状记忆现象提供新的实验数据，也为分析和评价红细胞衰老提供新的依据，并给血液储存和输血提供有益的指导和帮助。