基于光刻技术的小胶质细胞间通讯特性及机制的研究

As the first line of immune defense in the central nervous system (CNS), microglia could rapidly congregate together and establish a potential barrier between healthy and damaged tissue after the brain injury. However, little is known about how microglial cells communicate with each other effectively following the injury. Our previous work reported that three distinct pathways, including gap junction, paracrine and tunneling nanotube-like structures, could mediate cell-to-cell communication among BV-2 microglial cells in vitro. In this proposal, photolithography technology will be employed to pattern the layout of initial cell distribution to detailedly investigate the properties and mechanisms of above three intercellular communication pathways through detecting the intercellular calcium propagations in multi-BV-2 microglial cells in a controllable and quantitative manner. This study might provide new insights into mechanisms of microglia immune defense in the CNS.

小胶质细胞是中枢神经系统的第一道免疫防线，可在脑部受损时群体性激活，在正常细胞和受损细胞间快速集结形成保护屏障，但其如何实现快速有效的胞间通讯尚不明确。我们前期研究发现工具细胞BV-2小胶质细胞存在间隙连接、旁分泌和通道纳米管类似物介导的三种胞间通讯方式。为进一步可控、定量地研究上述三种胞间通讯，本项目拟基于光刻技术实现细胞在基底的图案化分布，并结合显微荧光成像技术，以BV-2小胶质细胞为研究对象，胞间钙波传递为观察载体，在多细胞体系下具体研究上述三种通讯方式的表观特性及关键机制，为阐明小胶质细胞快速有效保护中枢神经系统的机制提供新的思考视角。

小胶质细胞是中枢神经系统第一道防线，当发生神经损伤或感染时其迅速激活，并通过有效的细胞间通讯集体迁移至病灶区发挥免疫吞噬功能。本项目以BV-2小胶质细胞为研究对象，依靠光刻技术实现细胞在基底的图案化分布，结合微局域机械力刺激和荧光成像，在多细胞体系下可控、定量地研究BV-2小胶质细胞间钙波通讯特性和机制。首先阐明了旁分途径介导的BV-2小胶质细胞间钙波传递的主要钙来源是P2Y12/13受体相关的IP3敏感型钙库，介导钙波的信使分子为ATP/ADP。钙动力学变化特性对比分析发现钙波传递过程中细胞感受到信使分子的浓度约为0.3μM。基于同心圆图案和椭圆图案发现旁分泌途径介导的BV-2小胶质细胞间钙波通讯具有信使分子分泌刺激位置依赖性、信号中继放大性和信使分子感受部位敏感度差异性。基于点阵图案揭示了群体BV-2小胶质细胞自发钙振荡的频率具有密度依赖性。基于离散图案证明BV-2小胶质细胞间通道纳米管形成具有接触依赖性，其可以传递颗粒物质但无法介导钙波传递。利用哑铃状图案诱导BV-2小胶质细胞生成较长且稳定的细胞间桥，发现钙离子自由扩散和IP3依赖的钙库释放参与了子细胞间的钙波通讯。相关结果为阐明小胶质细胞快速、准确的保护中枢神经系统机制提供新的实验支撑和思考视角，也为体外研究细胞间通讯特性提供新的光刻图案化实验方案。