CD47-SIRPα调控氧化红细胞吞噬机制的超分辨成像研究

CD47 on erythrocytes inhibits phagocytosis by binding inhibitory immuno-receptor SIRPα expressed on macrophages. CD47 can function as an “eat me” signals on aged erythrocytes undergoing a conformational change. Deciphering the spatial organization of CD47/ SIRPα interaction is the key to understanding the mechanisms underlying activated phagocytosis. In our study, both super-resolution fluorescence microscopy and atom force microscopy will be applied to unraveling how CD47 are distributed within the plasma membrane. We will visualize CD47-SIRPα complex in sufficient detail to define the arrangement of individual molecules and observe how CD47 and CD47-SIRPα form clusters. Our study will gain new insights into the nanoscale organization of CD47/SIRPα signaling processes at single molecule level. Our work will provide new prospects in understanding of the phagocytosis during hypoxia, Ischemia-reperfusion (I/R) injury, radiation injury, and blood storage.

CD47-SIRPα相互作用对吞噬的调控机制是免疫学领域悬而未决的重要科学问题之一。红细胞膜蛋白CD47通过与巨噬细胞表面分子SIRPα相互作用抑制吞噬。凋亡、老化的红细胞CD47发生改变，由抑制吞噬的信号变为增强吞噬的信号。目前对CD47-SIRPα的空间组织方式缺乏研究，这是阻碍解析其调控机制的主要障碍。本项目拟采用超分辨荧光成像系统与原子力显微镜，从单分子水平揭示CD47-SIRPα复合物的超分辨结构，以及在TSP-1参与下CD47-SIRPα相互作用的关键分子事件。同时通过免疫学试验检测CD47表达量对红细胞吞噬的影响，以及氧化红细胞CD47引起的SIRPα下游信号。项目以氧化的红细胞作为模型，探讨CD47-SIRPα对吞噬的调控机制。为提高红细胞保存质量及降低输血不良反应奠定理论基础，并为控制心血管疾病、避免缺血再灌注损伤等临床应用寻找开发治疗靶点的新方向。

红细胞膜蛋白CD47通过与巨噬细胞表面分子SIRPα相互作用抑制吞噬。凋亡、老化的红细胞CD47发生改变，由抑制吞噬的信号变为增强吞噬的信号。目前对CD47-SIRPα的空间组织方式缺乏研究，这是阻碍解析其调控机制的主要障碍。针对上述问题，本课题从单细胞、单分子的层面，对红细胞衰老过程中CD47的表达量、TSP-1以及SIRPα与红细胞的结合数量、模式进行分析，结合免疫学手段，为揭示红细胞衰老过程中吞噬方式转换的机制提供线索。. 首先，dSTORM成像及相对定量分析结果表明，衰老红细胞表面CD47分子数目不断减少。一方面可能是由于细胞表面氧化损伤累积等导致CD47构象改变；另一方面则可能是随着红细胞的囊泡化，CD47分子不断丢失。. 其次，我们发现4N1K与构象改变的CD47结合，并诱导CD47成簇状分布。1）4N1K与来自老龄的CD47纯合小鼠红细胞结合显著增加。2）4N1K能够诱导CD47成簇相关参数的显著增加。3）脂筏可能参与了衰老过程中CD47的动态重组和成簇分布。. 第三，证明衰老/氧化的红细胞不能够向巨噬细胞传递吞噬抑制信号。1）氧化红细胞与巨噬细胞孵育时检测不到SIRPα的磷酸化信号，表明衰老/氧化的红细胞已经不能向巨噬细胞传递吞噬抑制信号。2）在添加4N1K的条件下，SIRPαex与氧化红细胞表面亲和力的增加，可能是通过CD47-SIRPα发挥巨噬细胞对红细胞的锚定作用。3）无4N1K时，氧化红细胞与巨噬细胞的结合指数高达约50%，表明衰老红细胞表面，可能存在其他机制激活吞噬途径，还需要进一步的深入研究。. 综上所述，我们的研究结果表明细胞膜表面存在两种类型CD47分子，衰老、氧化等使CD47分子发生构象改变。正常的CD47分子能够同SIRPα结合，传递吞噬的抑制性信号。当CD47构象改变时，TSP-1或TSP-1 peptide (4N1K)能够与构象改变的CD47结合，同时诱导CD47的成簇分布。此时，CD47/SIRPα之间不再传递吞噬抑制信号，主要发挥锚定作用。本文的研究为提高红细胞保存质量及降低输血不良反应奠定理论基础，并为研究有核细胞的凋亡，红细胞衰老相关疾病的研究等提供线索。