双基因"武装化"溶瘤痘苗病毒的靶向抗癌作用

我们近年提出癌症靶向基因-病毒治疗（Cancer Targeting Gene-Viro-Therapy, CTGVT）创新策略，将基因治疗和病毒治疗各自的优势结合起来。基于腺病毒载体的CTGVT已经取得极好的抗癌效果，并为国际学术界所重视。痘苗病毒具有天然肿瘤嗜性和大的载体容量。本项目设计采用双基因"武装化"靶向溶瘤痘苗病毒的抗癌策略，对我们已有的CTGVT成果加以为深化和完善。首先将前期工作中已证明具有强效抗癌活性的TRAIL和IL-24基因分别插入痘苗病毒的TK和VGF基因区,置于痘苗病毒合成早/晚期和晚期启动子控制下。预期该新型重组痘苗病毒一方面基于TK和VGF双基因插入失活，而具有增强的直接靶向溶瘤作用，另一方面其表达的外源双基因具有促凋亡作用、抑制肿瘤新生血管生成和诱导抗肿瘤免疫反应等效能及"旁杀伤效应"，各种效能协同将具有强烈抗癌作用。本项目通过体内外肿瘤模型研究相关抗癌机理

按原项目申请书拟定的研究计划，本项目采用重组痘苗病毒载体共表达肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）和白细胞介素-24（IL-24）两个抗癌基因，以构建溶瘤痘苗病毒，并研究其体内外抗肿瘤效应及机制。本项目已经完成了重组痘苗病毒的构建，Western blot检测验证了重组病毒感染靶细胞后目的蛋白产物和TRAIL和IL-24的表达，体外抗肿瘤实验显示，重组痘苗病毒表达双基因（TRAIL+IL-24）、单基因（TRAIL或IL-24或GM-CSF）乃至野型病毒均具有抗肿瘤凋亡杀伤活性，但其效能依次为：双基因（TRAIL+IL-24） > TRAIL > IL-24 > GM-CSF > MOCK，符合预期设计。除了上述项目申请书拟定的研究计划，我们还构建了共表达抗癌基因SMAC与IL-24及GM-CSF的重组痘苗病毒，并比较研究了双基因表达时几种连接肽在细胞内的剪切效率。结果表明，F2A 连接肽介导的蛋白剪切效果最好，而IETD和EEED连接肽剪切效率欠佳。MTT实验结果发现，无论是双基因溶瘤病毒还是对照单基因溶瘤痘苗病毒，在肺癌A549和H460细胞系的杀伤效果最好，且表达双基因的溶瘤痘苗病毒（共表达IL-24与Smac）比对照组病毒（空载病毒、表达IL-24或Smac单基因）对细胞的杀伤效果更好。在其他几个癌细胞系（宫颈癌细胞HeLa、结肠癌细胞SW620 以及肝癌细胞HepG2）中，病毒的杀伤作用都不明显。然而，本项目遇到一个意外的棘手难题，即重组痘苗病毒滴度难以提高，推测有可能是由于重组病毒表达产物TRAIL和IL-24均为凋亡诱导剂，可导致病毒产生细胞过早凋亡，严重影响病毒颗粒的组装，导致重组病毒产量难以提高。由于以上原因，在动物模型，抗癌预实验效果不理想，我们花费大量时间优化相关指标，仍未达预期效果。由于关键实验“卡壳”，致使动物实验部分在项目预定的时间内未能完成。我们决心即使在项目结题后，根据新的情况调整研究方案和优化实验步骤，仍继续完成该项目尚未完成的研究任务。