基于受体识别肽和细胞穿透肽的Survivin突变体T34A重组融合蛋白的靶向抗肿瘤效应研究

存活素(survivin)是凋亡抑制蛋白(IAP)家族的重要成员，它在几乎所有恶性肿瘤中都有较高表达，而在几乎所有正常成年已分化细胞中都不表达或仅低表达，是高度特异的肿瘤标志物。现有研究证明，抑制存活素表达或干扰其功能可诱导肿瘤细胞产生自发性凋亡，而对正常细胞则不产生明显影响。申请人在国外已完成的博士后研究首次证明，TAT转导肽(细胞穿透肽)融合的存活素T34A突变体能够在体外细胞培养水平和小鼠肿瘤模型上高效转导进入肿瘤细胞，并特异地导致肿瘤细胞的凋亡性杀伤，经腹腔注射使荷瘤动物已形成肿瘤体积比对照明显缩小。本课题延续上述工作，并加以实质性重要改进，在分子设计上，增添肿瘤受体特异性识别肽，使之成为一种具有通用广谱抗肿瘤活性的潜在I类新药。本课题将对所设计的重组融合蛋白分子表达，纯化，细胞转导，及其体内外特异性靶向抗肿瘤效应和凋亡相关机理加以研究，并比较分析其对肿瘤化疗/放疗增敏效应。

存活素(survivin)是凋亡抑制蛋白(IAP)家族的重要成员，它在几乎所有恶性肿瘤中都有较高表达，而在几乎所有正常成年已分化细胞中都不表达或仅低表达，是高度特异的肿瘤标志物。现有研究证明，抑制存活素表达或干扰其功能可诱导肿瘤细胞产生自发性凋亡。本项目构建和原核表达TAT转导肽融合的存活素T34A 突变体融合蛋白DV3-TAT-msvT34A，对其进行体内外抗肿瘤研究。在分子设计上，增添肿瘤受体特异性识别肽DV3，使该新颖融合蛋白能够特异识别和转导高表达CXCR4受体的肿瘤细胞，并通过诱导肿瘤细胞凋亡发挥抗癌效应。 . 本项目已完成的工作包括：设计DV3-TAT-msvT34A融合基因，并通过大肠杆菌原核表达系统表达DV3-TAT-msvT34A，产率可达菌体总蛋白的约50%，通过亲和层析和离子交换层析系列纯化，重组蛋白纯度达98.6％，在浓度为50nM时，重组蛋白的细胞转导效率为54.9％，在浓度为100nM时，重组蛋白的细胞转导效率为98.12％，重组蛋白转导细胞后，可在细胞内至少稳定24小时，Western blot和ELISA检测验证了重组蛋白的免疫特异性。此外，采用临床确诊的癌症（淋巴瘤、肺癌、肝癌和胃癌）患者血清标本研究证明，重组DV3-TAT-msvT34A融合蛋白可代替天然存活素蛋白，作为抗原试剂，用于ELISA检测患者血清存活素抗体，该项检测对广谱肿瘤筛查和肿瘤进展及预后监测可能具有重要意义。最后，MTT实验表明，重组DV3-TAT-msvT34A融合蛋白转导肿瘤细胞，可导致浓度依赖性肿瘤细胞杀伤作用，但其抗癌效应未达理想水平。重组蛋白的抗癌效应未达到预期水平可能与原核表达系统的包涵体复性等问题相关，相关实验条件仍需继续摸索优化。