猪CYP3A29催化赭曲霉毒素羟化代谢机制研究

The research of the transformation of Ochratoxin A in animals, confirmation of the key enzymes involved and the catalytic mechanisms of the enzymes, will probably provide new ideas to reduce the toxicity of Ochratoxin A towards livestock and humans. Our previous research indicated that cytochrome P450 (CYP) 3A29 is a critical metabolic enzyme in porcine liver, which can metabolize nifedipine and OTA. This study will use homology modeling and molecular docking methods to identified amino acid related to CYP3A29 metabolism of OTA, and use rapid PCR-directed mutagenesis and baculovirus-insect cell expression system in vitro recombinant expression CYP3A29, then use LC-TOF-MS and isothermal titration calorimeter mutant to analyse the metabolism of OTA and nifedipine. Integrating the results, we will get the important amino acid sites that affect the function of CYP3A29. The relationship between structure and function of the the CYP3A29 metabolism of OTA, and molecular catalysis mechanism of CYP3A29 will be revealed in swine.

研究赭曲霉毒素A (OTA)在动物体内的代谢转化过程，明确催化关键代谢步骤的酶，阐明其代谢分子机制，对于减少OTA毒素对畜禽甚至人的危害有着重要的理论指导意义。前期研究结果显示：细胞色素P450氧化酶 (Cytochrome P450, CYP) 3A29是猪肝脏中一个重要的代谢酶，它能代谢硝苯地平、OTA毒素。本研究在此基础上，利用同源建模和分子对接的方法确定与CYP3A29代谢OTA相关的氨基酸，并利用快速PCR定点突变技术和杆状病毒昆虫细胞表达系统在体外重组表达CYP3A29，利用飞行时间质谱和等温滴定量热仪对突变体代谢硝苯地平和OTA毒素进行分析，揭示CYP3A29羟化代谢OTA毒素的结构功能关系及分子催化机制。

OTA毒素的研究对于防止OTA毒素给人类和动物带来的危害以及提高动物的经济效益有着非常重要的意义。细胞色素P450酶是一类以血红素为辅基的B族细胞色素超家族蛋白酶，它们对药物在体内的代谢起着非常重要的作用，是最重要的一类药物代谢酶。CYP3A29是猪的一种非常重要的P450酶，它的表达量在猪CYP3A中是最高的，对外源物在猪体内的代谢起着至关重要的作用。本研究利用生物信息学技术确定CYP3A29中影响OTA毒素代谢的关键氨基酸残基即Arg105、Arg106、Phe108、Ser119、Lys212、Phe 213、Phe 215、Arg372和Glu374九个氨基酸Arg残基，之后以本实验构建好的表达载体pFastBac HTb-CYP3A29为模板，通过快速PCR定点突变技术构建突变体，然后利用杆状病毒昆虫细胞表达系统表达突变体，再将表达的酶与CYP3A29的特异性底物硝苯地平孵育测定酶的活性，观察这些突变对CYP3A29代谢硝苯地平的影响，最后利用液相质谱对CYP3A29代谢OTA毒素进行半定量研究，初步确定对CYP3A29代谢OTA有影响的氨基酸残基，再利用等温滴定量热仪进行确证，从而确定Arg105、Ser119和Lys212对CYP3A29代谢OTA毒素有着很关键的作用。结合CYP3A29代谢硝苯地平的实验，可以推测Arg105有可能是OTA毒素与CYP3A29的识别位点，突变Arg106使底物更容易进入酶的Arg105性中心，而Ser119和Lys212对CYP3A29的功能有重要的影响。