高致病性H5N1禽流感病毒PA相互作用宿主蛋白的鉴定及功能分析

Highly pathogenic H5N1 avian influenza virus (AIV) remains a substantial threat to public health. Therefore, it is crucial to explore the molecular basis and host mechanism for the high virulence of H5N1 AIV in mammals. Our previous study demonstrated that the PA gene-mediated lethal dissemination contribute to the high virulence of a H5N1 AIV strain in mice. However, it is unclear which host factors contribute to the virulence caused by PA gene. In this study, to further understand the pathogenesis of the PA gene, we will identify the host proteins that interact with PA protein and explore the potential biological significance of the interaction. The following experiments will be performed. First, we will construct the recombinant AIVs with His tag insertion in its PA-coding region based up a pair of AIVs that differ greatly in their virulence in mice. Second, cellular proteins interacting with PA will be identified by affinity chromatography and LC-MS/MS and bioinformatics. Third, the interaction of the cellular protein and PA protein will be confirmed by GST-pull down, co-immunoprecipitation and confocal microscopy assays. Finally, studies were also carried out to identify the molecular mechanism and biological significance of these interactions. This study may accelerate our understanding of the pathogenesis of the influenza virus.

高致病性H5N1禽流感病毒（AIV）能致死哺乳动物并可能获得气溶胶传播的能力。因此，迫切需要了解AIV致死哺乳动物的病毒和宿主机制。我们前期的研究发现PA基因所介导的病毒致死性扩散是H5N1 AIV致死小鼠的关键病毒机制。然而，PA基因发挥该功能的潜在宿主机制还不清楚。本研究旨在通过挖掘病毒感染过程中与PA相互作用的宿主蛋白并阐明其生物学意义从而进一步探索PA基因的致病机理。研究内容主要包括：（1）以对小鼠致病性差异显著的1对模式病毒为骨架，分别构建PA上融合表达His标签的嵌合病毒；（2）利用亲和层析结合液相色谱-串联质谱全面筛选与PA互作的宿主蛋白，用IPA等软件对宿主蛋白进行生物信息学分析；（3）用Co-IP、GST-pull down和激光共聚焦技术对相互作用进行验证；(4) 对互作机制以及互作蛋白的生物学功能进行分析和鉴定。研究结果将进一步加深对禽流感病毒致病机理的了解。

PA蛋白在流感病毒生命周期和致病性中发挥关键作用。然而，其发挥以上功能的宿主因素还不清楚。项目目标：① 全面筛选与模式病毒PA蛋白相互作用的差异宿主蛋白。② 差异宿主蛋白的鉴定和功能分析，阐明PA基因影响流感病毒致病性的潜在宿主机理。. 主要研究进展和重要结果：.1. 基于CK10病毒进行PA互作宿主蛋白的筛选和分析. 筛选到278种可能与CK10病毒PA互作的人类细胞蛋白。IPA、GO以及KEGG等生物信息学分析结果表明所筛选的互作宿主蛋白与流感病毒感染密切相关。Co-IP及细胞共定位发现NCL和eEF1A1与PA存在相互作用。.2. 基于模式病毒（CK10和GS10）进行PA互作差异宿主蛋白的筛选和分析. 基于由PA决定致病性差异的模式病毒进行PA差异互作蛋白的筛选，发现与低致病性的GS10相比，共有160种蛋白能与高致病性CK10病毒的PA蛋白特异性结合，包括eEF1A1。生物信息学分析结果表明这些差异宿主蛋白主要参与翻译、基因表达、病毒转录和病毒感染等生物学进程。Co-IP结果进一步证实eEF1A1只与CK10的PA存在互作。.3. PA与宿主细胞蛋白eEF1A1相互作用的生物学意义研究. 发现干扰eEF1A1显著提高CK10的复制效率、RNP活性、PA和NP核聚集能力、病毒mRNA、cRNA、vRNA合成、病毒诱导的细胞因子表达、抑制细胞坏死；而过表达eEF1A1显著降低CK10的复制效率。另外，eEF1A1也抑制H5N6和H7N9病毒复制，表明eEF1A1抑制流感病毒复制的广谱性。RNA-seq结果显示干扰eEF1A1后，多种炎症及免疫相关通路组分以及负调控细胞死亡相关基因表达上调，这与eEF1A1在CK10病毒感染期间抑制病毒复制、降低细胞因子表达和促进细胞坏死结果吻合，进一步证实表明eEF1A1的抗病毒作用。.4. PA与宿主细胞蛋白NCL相互作用的生物学意义研究. 进一步探索了NCL在CK10病毒感染人源细胞期间的潜在作用。发现NCL具有抗病毒作用，表现为抑制CK10病毒的复制效率、降低病毒的RNP活性、削弱病毒RNA的合成、抑制病毒诱导的细胞凋亡与坏死以及细胞因子免疫应答反应。