高致病性禽流感病毒H5N1血凝素蛋白中和表位鉴定及其功能研究

高致病性禽流感H5N1病毒的跨物种传播已经严重威胁到人类的生命安全。寻找H5N1 HA蛋白的中和表位有助于人感禽新型疫苗的开发。我们拟通过基因定位突变及血清学交叉反应检测方法，寻找H5N1 HA 蛋白的中和表位，在细胞和动物水平上检测它们的保护效果。并根据本课题组长期从事的γδ T细胞的研究工作基础，同时寻找γδ T细胞受体（γδ TCR）结合表位，构成组合表位，进一步研究它们的保护效果，为高致病性禽流感疫苗的研发提供新的策略和研究依据。

为寻找H5N1 HA蛋白的中和表位，以利于人感禽流感新型疫苗的开发，我们根据已有H5N1香港（人）株HA（HK- HA）、新疆（人）株HA（XJ-HA）和青海（禽）株HA（QH-HA）的基因序列，体外表达重组HA蛋白（rHA），制备抗各rHA的单抗。经假病毒中和实验及H5N1病毒感染或免疫人血清的鉴定，筛选具有中和活性的单抗；同时，通过不同毒株HA氨基酸序列比对及生物信息学分析，合成5-6或10-20肽。通过ELISA、肽阻断竞争ELISA，鉴定能阻断中和抗体与HA结合的候选中和表位。并用HA突变体进行的实验证明，124-129和158-162 氨基酸区氨基酸的突变可以改变其对抗体的亲和力。提示该区可能是中和表位之所在。最后，用串联候选中和表位为抗原，制备单抗，再用假病毒微中和实验，确定了中和抗体及该抗体识别的中和表位（LIKKNNAYPT、KSSFFRNVVW和RSSFFRVVVW）。获国内发明专利一项（ZL 2009 1 0083932.6）。为寻找γδT细胞受体（γδTCR）与H5N1病毒HA结合的表位，我们通过γδT细胞对H5N1病毒感染免疫应答的分子机制的研究发现，来自3个不同毒株的rHA在体外能够明显增加人PBMC中的γδT细胞表面早期活化标志物CD69的表达和IFN-γ的产生，提示rHA在体外能够诱导人PBMC中的γδT细胞活化；抗体封闭实验及γδT细胞表面PRRs或NKp46的检测证明，γδT细胞活化既不是TCRγδ或NKG2D介导的，也不是PRRs或NKp46介导的；最终证明H5N1的rHA通过唾液酸受体与γδT细胞结合，并进而导致γδT细胞活化，参与机体对H5N1病毒的免疫应答。工作发表SCI收录杂志【C M I (2013) 10, 463–470】。此外，我们应用以EBV永生化外周血记忆性B细胞，从H1N1疫苗接种者外周血中筛选甲型H1N1流感病毒血凝素蛋白人源中和单克隆抗体的新策略，从3名接受2009年流行的H1N1疫苗接种者外周血13090个永生化记忆B细胞中，筛选到7个对流行的H1N1病毒具有高中和能力和高血凝抑制活性的单克隆抗体，可用于感染患者的血清学治疗。该成功策略可应用于其他感染疾病高亲和力中和抗体的制备。工作发表在SCI收录杂志【C M I (2013) 10, 403–412】