伪狂犬病毒早期蛋白EP0靶向细胞内源性抗病毒蛋白PML的分子机制

Study on early viral proteins counteracting cellular intrinsic antiviral immune mechanism has become an important new way to further reveal the pathogenesis of infectious diseases in animals. The project, early pseudo-rabies virus protein EP0, endogenous intracellular antiviral protein PML (promyelocytic leukemia protein) and intracellular protein SUMO affect PML function as the research object, using the yeast two-hybrid system, co-immunoprecipitation, RNA interference confocal laser scanning techniques, to study the interaction EP0 pseudorabies virus early protein or non-SUMO and SUMO modification of PML to explore 1, molecular mechanisms of EP0 targeting SUMO modified PML 2, molecular mechanisms of EP0 direct targeting PML (non-SUMO modification of PML) with protein interaction. This study reveals interactions and mechanisms among EP0, SUMO and PML, for in-depth interpretation of pseudorabies virus early proteins EP0 counteracting PML-mediated cell intrinsic immunity mechanism provides a theoretical basis.

从细胞内源性免疫角度研究病毒早期蛋白抵御细胞抗病毒免疫机制，成为深入揭示动物传染病致病机理的重要新途径。本项目以伪狂犬病毒早期蛋白EP0、细胞内源性抗病毒蛋白PML（早幼粒细胞白血病蛋白）和细胞内影响PML功能的SUMO蛋白为研究对象，利用酵母双杂交、免疫共沉淀、RNA干扰、激光共聚焦等技术，研究伪狂犬病毒早期蛋白EP0与SUMO化或非SUMO化修饰的PML之间的相互作用，探讨1、EP0靶向SUMO化修饰PML的分子机制。2、EP0直接靶向PML（非SUMO化修饰PML）的分子机制，揭示EP0、SUMO、PML三者之间的相互作用和作用机制，为深入阐释伪狂犬病毒早期蛋白EP0破坏PML介导的细胞内源性免疫机理提供理论依据。

固有免疫（intrinsic immunity）是一种不同于获得性免疫的细胞抗病毒免疫机制。早幼粒细胞白血病蛋白核体（PML 核体）是细胞对病毒进行固有免疫的场所。p53作为一种关键的细胞转录因子，在细胞对多种应激因子的应答中起着核心作用，一般被认为是各种病毒感染的宿主细胞限制性因子，跟宿主的固有免疫具有密切关系。因此本课题采用了分子生物学技术、酵母双杂交、GST pulldown等经典方法研究了EP0靶向PML核体的分子机制，同时也对p53在伪狂犬病毒感染过程中所起的作用进行了研究。取得了如下研究成果：（1） 构建了PK-15细胞酵母双杂交cDNA文库，体外表达了EP0蛋白、SUMO1、SUMO2和SUMO4蛋白，明确了PRV EP0 蛋白与 PML 核体内主要蛋白类泛素化蛋白1（SUMO1）能够直接相互作用。（2）构建了一个过表达的p53猪肾上皮细胞系(PK-15)来检测p53对体外PRV复制的影响。结果表明，p53过表达PK-15细胞的病毒糖蛋白B (gB)基因拷贝数和病毒滴度明显高于p53过表达PK-15细胞和p53抑制剂处理的p53过表达PK-15细胞。类似的结果也发现p53抑制剂PFT-α-treated PK-15细胞。然后我们用p53敲除(p53-/-)小鼠检测p53在体内对PRV感染的影响。结果表明，敲除p53不仅显著降低了小鼠颅内接种后的死亡率，而且降低了病毒性脑炎病毒在小鼠大脑中的复制和发育。此外，我们还通过RNA测序检测了p53敲除对小鼠大脑中已报道的PRV复制宿主细胞调节剂表达的影响。结果表明，p53的敲除降低了PRV感染后干扰素(IFN)调节基因、趋化因子基因和抗病毒基因的表达。综上所述，本研究从固有免疫的角度明确 PRV EP0蛋白在病毒感染早期的致病机制中起到的作用，且p53在体外和体内均能积极调控病毒复制和发病机制，对于阐明伪狂犬病毒早期感染中的致病机制具有重要意义。