鳗鲡疱疹病毒结构蛋白的鉴定及其在病毒粒子上的定位研究

我们利用建立的鳗鲡细胞系从收集的病料中分离了一种鳗鲡病毒，经空斑纯化、电镜观察和核酸鉴定，确定该病毒为给许多国家的鳗鲡养殖业造成巨大损失的鳗鲡疱疹病毒，这也是我国首次分离出该病毒。明确结构蛋白的组成及其编码基因是开展病毒基础和应用研究的重要前提。本项目将运用几种具有互补性的蛋白质组学技术测定该病毒病毒粒子蛋白的肽段序列，通过生物信息学分析确定其编码基因；进一步表达鉴定蛋白，制备其多克隆抗体，通过western blot确认病毒的结构蛋白组成；分步裂解、超速离心分离病毒的囊膜及核衣壳，进行western blot分析，结合免疫电镜、序列分析结果，确定病毒的囊膜蛋白基因和核衣壳蛋白基因；并对主要囊膜蛋白的基因特性及其与宿主的相互作用进行研究。这不仅可丰富我们对鱼类疱疹病毒的生物学了解，还为研究该病毒的致病机理及其与宿主的相互作用，建立病毒的免疫学检测方法及开发疫苗提供重要的研究基础和理论依据。

鳗鲡病毒病已经成为制约我国鳗鲡养殖业健康发展的重要瓶颈。本项目利用从台湾引进的EO细胞分离了一株鳗鲡病毒，经形态观察和DNA分析，确认该病毒为鳗鲡疱疹病毒(AngHV-FJ)，这也是在我国大陆首次分离出该病毒；AngHV是一个普遍存在并对养殖的淡水鳗鲡造成巨大经济损失的病毒性病原，在养殖的日本鳗鲡(Anguilla japonica)和欧洲鳗鲡(Anguilla anguilla)上经常报道该病的爆发;根据对AngHV基因组的生物信息学分析及van Beurden等(Veterinary Research, 2011, 42:105)对AngHV-1病毒粒子结构蛋白的研究结果，对编码结构蛋白的ORF4、ORF8、ORF49、ORF51、ORF66、ORF71、ORF78、ORF95、ORF115等基因进行了克隆、表达及多克隆抗体的制备；构建了可表达鲤春病毒血症病毒(SVCV) G蛋白不同结构域片段的转移载体，进一步构建了可融合表达AngHV-FJ ORF33、ORF51、ORF95等基因的重组杆状病毒Bacmid，在家蚕细胞中对相关蛋白进行了表达，通过免疫鳗鲡确定这些蛋白都具有比较好的免疫原性，为疫苗的开发奠定了重要基础；建立了AngHV-FJ的快速检测方法，收集鳗鲡种苗、疑似病料，并结合流行病学、临床症状、病理变化等对AngHV-FJ病进行分子流行病学调查，基本明确了发病的规律和流行情况；另外，对鳗鲡“狂游病”等主要鳗鲡疾病的致病病因进行了分析。研究结果不仅为研究鳗鲡疱疹病毒病的致病机理、建立鳗鲡疱疹病毒的免疫学检测方法及开发疫苗提供了重要的研究基础，还加深了我们对鳗鲡“狂游病”等鳗鲡主要病毒病的了解，为鳗鲡病毒病的综合防控奠定了重要研究基础。