miR-200c调控UBC9表达诱导深低温停循环下脑缺血耐受的机制研究

Cerebral injury after deep hypothermic circulatory arrest（DHCA）process is a tough clinical problem to be urgently resolved. Inducing cerebral tolerance to ischemia is an effective measure to ameliorate cerebral damage, but its protective mechanism has not been fully elucidated. Hibernating is an excellent model of natural tolerance to ischemia, during which the pathophysiological conditions of the brain are similar to that of DHCA. Current study identified that massive global SUMOylation, overexpression of ubc9 and inhibition of the miR-200c occured during hibernation torpor in ground squirrels. SUMOylation regulated by ubc9 was the key factor of cerebral tolerance to ischemia. Our previous study found that miR-200c was downregulated during DHCA, and three softwares predicted ubc9 is the target of miR-200c. We inferred that DHCA stress downregulated miR-200c to active SUMOylation by targeting ubc9. This may be a new mechanism of cerebral tolerance to ischemia. To confirm the new hypothesis from the cellular level identification of the exact target of miR-200c; We focus on the function of miR-200c,which can regulate ubc9, by using vivo rats DHCA model and tools such as luciferase reporter vector and miR-200c lentiviral vector. We will explore the possible mechanism of miR-200c mediating the ubc9 signal pathway activation in inducing cerebral tolerance to ischemia. This project aims to look for a new and interventional target, laying theoretical basis for preventing neurologic dysfunction after DHCA process.

深低温停循环（DHCA）后脑损伤是临床亟待解决的难题，诱导脑缺血耐受是行之有效的措施，然其机制未明。动物冬眠作为天然的缺血耐受模型，与DHCA下大脑所处病理生理状况相似，极具借鉴意义。研究发现，冬眠期动物脑组织出现SUMO化、ubc9上调和miR-200c下调；其中，ubc9介导的SUMO化是诱导脑缺血耐受的关键环节。我们发现，miR-200c在DHCA动物海马组织显著下调，且三个靶点预测软件均提示ubc9为miR-200c的下游靶点。因此，本研究提出"DHCA通过下调miR-200c，促进ubc9表达升高，提高脑组织SUMO化水平，诱导大脑缺血耐受"的新假说。拟以大鼠DHCA模型和SHSY5Y细胞为基础，荧光素酶报告载体和miR-200c慢病毒为工具，探讨miR-200c调控ubc9诱导大脑缺血耐受的可能机制，寻找全新且具干预性的靶点，为防治DHCA后神经功能障碍打下坚实的理论基础。

深低温停循环后脑损伤是临床亟待解决的难题，诱导脑缺血耐受是行之有效的措施，然机制未明。研究发现，冬眠期动物脑组织出现 SUMO 化、ubc9 上调和 miR-200c 下调；其中，ubc9 介导的 SUMO 化是诱导脑缺血耐受的关键环节。.本项目采用视磺酸诱导SHSY5Y分化的类人神经细胞建立离体深低温停循环模型并以此为基础展开细胞实验部分研究，构建荧光素酶报告载体确认miRNA200c与UBC9蛋白的调节关系。另一方面，本项目构建了稳定的深低温停循环联合选择性脑灌注兔模型，并对兔脑进行代谢组学分析。.荧光素酶报告结果显示：miRNA200c可以调控UBC9蛋白表达(P<0.05, n=3)，在结合位点突变后这种调控关系消失(n=3, P<0.05)。.类人神经细胞离体实验结果显示，糖氧剥夺4h使LDH漏出量显著增加，低温可减少LDH漏出（P<0.05，n=6）；低温干预可上调结合态SUMO1表达，温度越低表达量越高，18℃组明显高于30℃组（P<0.05，n=6），但18℃组与26℃组差异无统计学意义(P>0.05,n=6);低温干预可同时上调结合态及游离态SUMO2/3表达（P<0.05，n=6），但与37℃糖氧剥夺组相比，并不额外增加SUMO2/3蛋白结合游离比（P>0.05，n=6）; 糖氧剥夺损伤4h再灌注24h后Caspase-3蛋白水平明显上调，低温干预下调Caspase-3表达（P<0.05，n=6）。动物实验方面，成功建立深低温听循环联合脑灌注模型，生命体征和血气指标在整个实验过程中变化在可接受的范围内，心脏停搏液灌注后血液稀释明显，终止CPB后红细胞压积明显改善，与深低温停循环组相比，深低温停循环联合脑灌注组62种代谢产物差异显著，代谢组学分析表明，DHCA后ASCP代谢途径主要涉及激活糖酵解途径、抑制厌氧代谢和氧化应激。.研究结果低温可增加SUMO蛋白表达水平，促进SUMO蛋白结合，从而提高神经细胞抗缺血缺氧耐受能力，短时间缺血缺氧情况下，中低温和浅低温的神经保护作用，与深低温的保护效果相近，为临床工作中低温停循环的调整温度提供分子学依据。从代谢的角度探索深低温停循环与选择性脑灌注可能的损伤及保护机制有助于进一步减轻再灌注损伤，改善心脏手术患者神经系统预后。