狂犬病病毒感染相关宿主miRNA的鉴定及功能分析

宿主和病毒在miRNA调控水平上存在着复杂的相互作用。前期工作基于基因芯片技术分别研究了狂犬病病毒感染鼠脑和原代神经元的mRNA和miRNA表达谱，提示狂犬病病毒与宿主在miRNA水平上存在互作。本研究拟以miRNA表达谱遴选出的miRNA为研究对象，以狂犬病病毒致神经功能异常为主要研究目标，通过生物信息学数据分析、miRNA和mRNA反向表达的规律和实验验证等分辨出功能性miRNA→靶基因的靶向关系，获得狂犬病病毒感染致病相关miRNA分子；应用过表达和基因沉默等技术在离体和在体水平上确证目的miRNA→靶基因靶向关系与病毒感染及致神经功能异常之间的内在关联，最终揭示病毒→细胞信号通路→转录因子→目的miRNA→靶基因→下游通路等→病毒感染表型或致神经功能异常表型的机制。研究成果不仅可为揭示狂犬病病毒致病机制积累学术基础，也可为狂犬病临床治疗的突破提供些许提示。

狂犬病病毒（Rabies virus，RV）是一种典型的神经嗜性病毒，受感染宿主的脑内少见炎性变化和神经元的退行性改变，RV致死宿主的主因是导致宿主神经元功能紊乱。microRNA（miRNA）是一种小分子非编码RNA，越来越多的证据显示其构成了生物机体内一个重要的基因表达调控层次。对病毒而言，通过miRNA基因调控网络，病毒可以最大限度的改变细胞内的分子环境，并利用宿主细胞内的装置进行感染、复制和完成致病过程。我们拟以宿主miRNA为切入点探求RV感染致病的分子机制。. 首先，以RV街毒株感染小鼠脑皮层原代神经元模型为研究对象，以miRNA芯片为筛选技术平台，共筛选出众多表达差异显著的miRNA。以RV感染后表达持续递增的19个和递减的34个miRNA为研究重点，运用RT-PCR方法在RV街毒株/固定株感染小鼠脑海马组织（体内）和鼠原代神经元（体外）上分别验证出10个miRNA分子。利用生物信息学工具预测其潜在的靶基因，并对靶基因集合进行GO注释等分析。最终确定了miR-29a-STX1A、miR-9-MCPIP1、miR-9-IRF1等数个待验证的互作对。. 在逆向寻靶的研究中，我们专注于突触这一关键的神经元功能部位。成功建立了小鼠海马突触体的提取方法，并利用定量蛋白质组学技术鉴定了RV街毒株感染前后突触体内差异表达的蛋白分子。生物信息学分析和蛋白互作网络构建的结果显示差异表达蛋白多与神经递质释放等神经元功能密切相关。从中选取并利用western blot验证了5个蛋白，并对潜在调控这5个蛋白的miRNA进行了预测，继而确定了待研究的miR-181与α-synuclein、miR-23与α-synuclein互作对。. 在功能学的研究中，利用荧光素酶报告基因等技术确证miR-29a与STX1A、miR-9与MCPIP1、miR-9与IRF1的靶向关系。证实了RV感染→miR-9表达上调→IRF1表达抑制→病毒复制增加。初步确证了RV感染→miR-29a表达上调→STX1A表达抑制→影响了神经元突触囊泡的循环。. 本项目执行证实了基于宿主miRNA的RV-宿主互作的学术观点，所获大量组学数据为RV与宿主基于宿主miRNA的研究提供了大量数据信息，为我们下一步研究提供了依据、指明了方向，并可为他人从事提供有益的借鉴。