四物汤有效成分靶向细胞NF-κB信号通路的辐射相关机制研究

在国家自然科学基金课题"四物汤组方原理的基础研究（30070913）"、"四物汤干预血虚证的蛋白质组学相关性研究（30371725）"、"基于代谢组学的四物汤作用机制深入研究（30672628）"等的前期工作基础上，综合应用现代生物学技术，建立TLR5受体介导的NF-κB激活剂筛选模型和适于天然药物抗辐射损伤的体内外筛选效应评价方法；从已有的四物汤有效物质基础（果糖、芍药苷、阿魏酸、川芎嗪等）中筛选获得能激活NF-κB信号通路的有效成分，并进行抗辐射损伤效应评价，分别在整体、细胞和分子水平对候选有效成分进行抗辐射损伤机制研究，揭示和完善四物汤抗辐射损伤作用机制及调控网络，基本阐明四物汤抗辐射作用靶点及作用机理。通过相关药物的反证结合研究，揭示该方剂对辐射损伤的防治规律，为四物汤抗辐射作用机理的系统研究提供科学依据。

现代社会放射性技术应用越来越广，目前研发抗辐射药物特别是天然新型低毒的中草药倍受人们关注。国外基于TLR5（Toll-like receptor 5）-NF-κB(nuclear factor-κB)信号通路研制的CBLB502具有很好的抗辐射效果。本课题基于这一新思路，探索四物汤有效成分是否通过TLR5受体激活细胞NF-κB信号通路，进一步揭示四物汤中有效成分的抗辐射作用机制，确定靶向NF-κB通路的新型抗辐射药物。. 首先建立TLR5-NF-κB 通路报告基因系统，筛选四物汤有效成分，四物汤中果糖、腺嘌呤、川芎嗪、叶酸、东莨菪内酯、阿魏酸能显著性激活HEK 293 细胞表面TLR5 受体及其下游的NF-κB 通路。2-8 Gy 60Co 照射导致淋巴母细胞AHH-1 死亡，辐射早期以细胞凋亡为主要死亡方式，呈辐射剂量依赖性增加，且随着辐射时间延长，照射剂量增加，坏死细胞逐渐增多，细胞活力随之减低，DNA损伤程度加剧。加入川芎嗪或腺嘌呤后能够增强辐射损伤淋巴母细胞的活力，说明川芎嗪或腺嘌呤具有一定的体外抗辐射活性。这种抑制凋亡的活性作用可能与凋亡相关因子Caspase-3/7 活性的下降，促凋亡因子Bax，Caspase-9 mRNA 表达的降低和凋亡抑制因子Bcl-2 mRNA 表达的升高，以及NF-κB 核转位密切相关。阿魏酸具有较好的抗辐射作用，能有效地抑制辐射引起的细胞损伤，提高细胞活力，抑制细胞凋亡。阿魏酸能抑制辐射诱导的细胞过氧化损伤，提高各种抗氧化基因的表达，降低辐射引起机体活性氧的增多，促进照射后Nrf2由胞质向胞核的转移，其作用机制极有可能是启动了Nrf2-ARE信号通路进而引发抗氧化基因的表达。联合用药的体内外实验研究表明：E0703、rhIL-11、新型四物汤联合用药组是最佳配伍方案，其可以有效的提高小鼠存活率；该联合的抗辐射效应可能通过激活TLR5 介导的NFκB 信号通路，提高细胞活力，改善受照小鼠外周血象情况，增加骨髓造血祖细胞集落而发挥疗效。. 课题基于TLR5-NF-κB信号通路从四物汤中筛选出腺嘌呤、川芎嗪、阿魏酸等有效成分，并对其辐射防护作用机制进行了深入研究，进一步对其联合用药的效果进行了系统考察。课题对辐射防护药物的机制研究和新药候选研究具有重要意义。