生物膜对变形链球菌sec蛋白分泌途径调控影响的研究

Streptococcus mutans has been implicated as a principal etiological agent in human dental caries. S mutans produces several virulence factors such as glucosyltransferases(GTFs), fructosyltransferase (FTF) and PAc, these virulence factors play pivotal role in the formation of dental plaque and the development of dental caries in humans. The highly conserved Sec pathway is the main pathway for protein transport in bacteria. In our research, we firstly discuss the process of biofilm formation will regulate protein secretion which via sec pathway in streptococcus mutans ① We observe the microdomain which relate to protein secretion and the subcellular localization of secA by immunogold electron microscopy. ② We build an in vitro biofilm model and using GTF、FTF and Pac as tracer targets to compare differences about the function of secA in planktonic culture, biofilm condition and different periods in the process of biofilm maturation.③We construct secA deletion mutant strain and observe the growth, protein secretion and biofilm formation of the mutant. ④We investigate how environmental stress modulates and effects the Sec pathway. Our study proved the general secretory (Sec) pathway play important role in protein secretion by streptococcus mutans, The study can help us to deepen our understanding about how the process of biofilm formation effects the virulence factors secretion by sec pathway, and we will have some new ideas about the formation of caries-induced dental plaque from this study.

牙菌斑生物膜中的变形链球菌是人类龋病的主要致病菌，它分泌产生的致龋毒力因子与牙菌斑形成及龋病的发生密切相关，在这一过程中Sec蛋白分泌途径发挥了重要作用。本研究根据变形链球菌的生长致龋特性，首次探讨生物膜的形成对于变形链球菌蛋白分泌活动调控的影响。①使用免疫金标技术观察与蛋白分泌有关的微结构区域，进行Sec蛋白的亚细胞定位；②通过体外构建生物膜模型，比较变形链球菌在生物膜牙菌斑状态下和浮游状态中Sec蛋白表达的差异，了解生物膜形成对于Sec分泌途径的影响；③构建Sec蛋白缺陷株，观察变形链球菌生长、蛋白分泌以及形成牙菌斑的变化；④观察环境变化对变形链球菌Sec分泌途径的调节，了解生物膜形成时的生长条件的变化对于Sec分泌途径的影响。本研究有助于更深入地了解牙菌斑生物膜的形成对于变形链球菌依赖的Sec蛋白分泌途径活性的调控，丰富对于Sec蛋白分泌途径的认识，并可能为龋病预防提供新的思路。

变形链球菌已被确认是导致人类龋病的最主要致病菌，其致龋性主要体现在通过分泌毒力因子，介导粘附形成牙菌斑生物膜，进而产酸使牙体硬组织脱矿产生龋病。在前期研究工作中我们证明Sec分泌途径在变形链球菌的蛋白分泌中发挥重要作用。本研究根据变形链球菌的致龋特点，首次探讨生物膜的形成对于变形链球菌蛋白分泌活动调控的影响。①使用免疫金标技术观察与蛋白分泌有关的微结构区域，进行Sec蛋白的亚细胞定位；②通过体外构建生物膜模型，比较变形链球菌在生物膜牙菌斑状态下和浮游状态中不同时期Sec蛋白表达的差异，了解生物膜形成对于Sec分泌途径的影响；③构建Sec蛋白缺陷株，观察变形链球菌生长和蛋白分泌及形成牙菌斑的变化；④了解生物膜形成时的生长条件的变化对于Sec分泌途径的影响。本研究有助于更深入地了解变形链球菌依赖Sec途径的蛋白分泌活动与牙菌斑生物膜形成之间的相互影响，可能对致龋牙菌斑的形成产生新的认识。.在本研究中，我们为了观察sec途径在变形链球菌蛋白分泌发挥的作用，我们使用两种大小差异显著（15nm与5nm）的胶体金二抗分别标记SecA和毒力因子蛋白（GTF和SBR）。在透射电镜下观察发现SecA蛋白的亚细胞分布与分泌蛋白的分布方式是一致的，都呈现出集中分布的趋势，二者在空间上的共同分布有力的证实了sec分泌途径在变形链球菌蛋白分泌中发挥的作用。同时发现secM蛋白与secA蛋白亚细胞分布方式也是一致的。分别提取浮游状态下和生物膜状态下的变形链球菌的总RNA与胞浆蛋白，结果表明生物膜状态下变形链球菌毒力因子基因表达与蛋白表达水平明显高于浮游状态（p＜0.05），并且secA，secM基因与蛋白表达水平在生物膜状态下也有显著上调，与浮游状态比较有显著性差异，SecA，secM的表达在生物膜状态下显著高于浮游状态。.生物膜的形成是一个复杂而连续的过程，在生物膜形成过程中，变形链球菌的生长环境发生了巨大的变化，细菌的蛋白分泌活动必须适应这一变化，从而可以在生物膜这一微环境中继续生存并且致龋，Sec分泌途径也必须随着细菌生长环境的变化而调整分泌活性，以满足细菌正常生理活动的需要，我们证实了生物膜的形成会通过影响SecM表达从而可以影响调控Sec分泌途径的活性，加深了我们对于Sec分泌途径的认识，并且可能对龋病的预防产生新的思路。