血管内皮前体细胞对人胚胎胰腺干细胞向胰岛内分泌细胞分化的影响及机制研究

Islet aggregated by pancreatic endocrine cells differentiated from stem cells is a solution of donor organ shortage of islets transplantation. However, the low differentiation efficiency and immature function are two major problems to directed stem cell differentiation into production of insulin-producing cells, which are not solved yet. During the development of pancreas, endothelial progenitor cells (EPCs) are necessary for endocrine specification. Our previous study found that co-culturing with human fetal aortic endothelial cells enhanced the efficiency and function of human fetal pancreatic stem cells differentiated into islet endocrine cells. In this study, we first investigate the effects of EPCs on the efficiency and function of human fetal pancreatic stem cells directed differentiation into endocrine cells. Then the levels of HGF, CTGF, VEGF and extracellular matrix components as well as their effects on differentiation will be analyzed. Moreover, the activities of Notch, Akt, ERK and TGF-β signalings were compared between co-culturation group and control. In addition, the factors and signaling pathways will be screened by microarray from co-culturation group and control. At last, new induction protocal will be estalblished by improving original method on the basic of new findings. This work will provide experimental data for unravel the mechanism of islet development and support the application of stem cell technology in diabetic therapy.

制备干细胞分化的胰岛是解决胰岛移植供体短缺的一种有效手段。然而，干细胞向胰岛内分泌细胞细胞定向诱导分化存在分化效率低和细胞成熟度差两个瓶颈问题始终没有得到解决。在胰腺发育过程中，血管内皮前体细胞（EPCs）对胰岛内分泌细胞的分化是必需的。我们前期研究发现，采用EPCs共培养可以明显提高人胚胎胰腺干细胞向胰岛内分泌细胞分化的效率和胰岛素释放能力。本研究拟在此基础上，首先通过体外实验和体内实验分析EPCs对人胚胎胰腺干细胞分化效率和成熟度的影响；然后通过检测HGF、CTGF、VEGF和细胞外基质成分等分析EPCs产生的促分化因子，并分析共培养组对干细胞Notch、Akt、ERK和TGF-β信号通路的影响；此外，应用表达谱芯片筛选干细胞中受EPCs调控的分子和信号通路；最后根据机制分析的结果改进体外定向诱导干细胞向胰岛内分泌细胞分化的诱导方案，为干细胞技术在糖尿病治疗中的应用奠定基础。

干细胞技术是治疗糖尿病，特别是逆转糖尿病并发症的潜在治疗手段。然而，干细胞向胰岛内分泌细胞细胞定向诱导分化存在分化效率低和细胞成熟度差两个瓶颈问题始终没有得到解决。在胰腺发育过程中，血管内皮前体细胞（EPCs）对胰岛内分泌细胞的分化是必需的。在本项研究中，我们利用分离培养的人EPCs和人胚胎胰腺干细胞进行共培养，研究了EPCs对人胚胎胰腺干细胞向胰岛beta细胞分化的影响及机制。结果发现：采用EPCs共培养可以明显提高人胚胎胰腺干细胞分化为胰岛素阳性细胞的比例和葡萄糖刺激的胰岛素释放能力。对EPCs分泌的多种物质进行分析，发现EPCs可产生的多种细胞外基质，促进干细胞分化成熟。进一步对EPCs的作用机制进行分析发现，和EPCs共培养后，人胚胎胰腺干细胞内转录因子PDX-1、Sox9和Ngn3表达增加，Notch1表达降低，Hes1变化不明显。通过基因表达谱芯片筛选差异表达基因发现，EPCs共培养组较单纯培养组除上述转录因子变化外，维生素D受体（VDR）增加明显，提示VDR信号通路参与EPCs的促分化功能。在干细胞诱导分化时给予VDR的配体1,25(OH)2D3，也明显提高了胰岛素阳性细胞比例和胰岛素释放能力。此外，我们对1,25(OH)2D3促进干细胞分化的机制也进行了研究，发现1,25(OH)2D3通过上调smad3的表达，抑制了Notch1的水平，从而促进人胚胎胰腺干细胞向胰岛素分泌细胞的分化。根据上述所发现的促进干细胞向胰岛素分泌细胞分化的机制，我们将干细胞向胰岛beta细胞分化的体外诱导方案进行了改进，最终确定的体外诱导分化方案为：M199基础培养基，添加15%胎牛血清、10-8M GLP-1（或其受体激动剂）、2.5mM尼克酰胺，10-8M 1,25(OH)2D3，连续诱导4周后进行悬浮培养诱导成胰岛样结构，在悬浮培养基中添加IV型胶原（5ug/ml），层连蛋白（2ug/ml）和纤连蛋白（2ug/ml），悬浮培养12-24h后收获胰岛。采用新方案可使干细胞向胰岛素阳性细胞分化效率提高15%。本研究的结果不仅为阐明人胰腺干细胞向胰岛beta细胞分化提供实验依据，而且为提高干细胞体外分化成熟能力，促进干细胞技术在糖尿病治疗中的应用奠定基础。