绵羊卵母细胞对体细胞再程序化机理的研究

体细胞核移植技术是利用哺乳动物的卵母细胞对已分化的体细胞进行再程序化的一项技术。该技术在细胞生物学基础研究领域以及农业、医疗等应用领域都具有极其重要的意义。然而，极低的成功率限制了该技术在上述领域中的应用。弄清卵母细胞对体细胞再程序化的机理是提高该技术成功率的前提。本项目组成员在总结前人有关体细胞再程序化相关技术及机理的前提下，结合真核基因表达调控、表观遗传学的相关研究进展，较为系统地提出了哺乳动物卵母细胞对体细胞再程序化的可能机理，并拟以绵羊体细胞核移植胚为研究对象，采用胚胎工程、细胞生物学、分子生物学、免疫学以及表观遗传学的相关技术，验证我们所提出的机理的正确性。此外，该项目提出了影响体细胞核移植技术成功率的一些可能因素，并拟通过实验对这些可能的影响因素进行验证。该项目的研究成果可为体细胞核移植技术奠定理论基础，并为提高该技术的成功率奠定技术基础。

哺乳动物成熟的卵母细胞具有再程序化体细胞的能力。然而，相关的机理及其影响因素还未完全阐明。本课题以绵羊成熟的卵母细胞、皮肤成纤维细胞、体细胞核移胚、体外受精胚及孤雌激活胚为实验材料，采用免疫组化、RT PCR、real-time RT PCR、流式细胞术、甲基敏感扩增多态性及亚硫酸氢盐修饰后测序等技术，系统研究了以下几个方面的问题：（1）在早期胚胎发育过程中，成熟卵母细胞中预先合成的母源因子与卵母细胞来源的或体细胞来源的染色体动态结合及分离的过程；（2）处于不同发育阶段的核移胚中表观遗传修饰的变化趋势；（3）体细胞基因组的沉默与否对核移胚早期发育的影响；（4）核移胚早期发育过程中，一些多潜能基因能否正常激活及其启动子区域DNA的甲基化状态。结果表明：（1）由于成熟卵母细胞中的不同母源因子与卵母细胞浓缩染色体的结合模式不同，去核会导致其不同程度的丢失，核移胚激活后，残存于卵胞质中的母源因子与体细胞去浓缩的染色体结合模式也不相同。（2）部分核移胚在早期发育过程中的表观遗传修饰变化趋势异常，DNA甲基化水平呈先减少、后增加的趋势；H3K9ac、H3K27ac、H3K9me3及H3K27me3水平变化趋势不明显；H3S28ph水平呈逐渐增加的趋势。（3）某些核移胚中体细胞特异性基因未能完全沉默。为此，采用完全汇合结合血清饥饿法预处理核供体细胞，可诱导更多细胞进入G0/G1期，影响细胞周期相关基因的表达，有利于体细胞特异性基因的沉默，预处理后的核供体细胞用于核移植，核移胚具有更高的体外发育率，但对核移胚的质量没有影响。（4）部分核移胚虽能够发育到桑椹胚甚至囊胚阶段，但某些多潜能基因无法正常激活，最终影响其后续发育。多潜能基因无法正常激活可能与其启动子区域DNA超甲基化有关，相关研究有待进一步进行。本项目较为系统地探究了绵羊卵母细胞对体细胞再程序化的机理及体细胞核移植技术低成功率的原因，即哺乳动物成熟卵母细胞中预先合成的大量母源因子是其能够再程序化体细胞的根本原因，然而，不同母源因子与成熟卵母细胞中浓缩染色体的结合模式不同，去核可导致母源因子部分或全部丢失，影响其对体细胞的再程序化，导致核移胚中某些表观遗传修饰模式异常，某些多潜能基因无法正常激活，某些体细胞特性基因无法正常沉默，最终影响核移胚的发育。本项目的研究成果可为提高体细胞核移植技术的成功率奠定理论及技术基础。