斑马鱼体细胞核移植胚胎再程序化重要基因的克隆与分析

核移植后重构胚的重编程研究一直是一个经典并极富挑战性的课题。虽然多种动物已被成功克隆，但是获得克隆动物的成功率不足5%，且重构胚普遍存在遗传和发育方面的问题。越来越多的实验结果提示重构胚的诸多问题都可归咎于核移植后发生了不完全的再程序化，但其分子机制尚不清楚。申请者前期研究检测到囊胚期败育的体细胞重构胚96个基因相对于受精胚异常表达，提出核移植后重构胚早期发育的再程序化过程中可能存在几个关键调控因子。本项目拟以斑马鱼体细胞重构胚为模型，研究核移植后重构胚早期发育的再程序化分子机制。采用抑制性差减杂交技术大规模筛选核移植后原肠期shield stage体细胞重构胚相对于受精胚差异表达的基因谱；通过生物信息学分析和体外共转染特定因子技术鉴定2-4个再程序化因子，并初步研究其在重构胚早期发育的再程序化调控网络中的功能；以期为分子水平揭示斑马鱼体细胞重构胚早期发育的再程序化机制提供理论依据。

核移植后重构胚的重编程研究一直是一个经典并极富挑战性的课题。虽然多种动物已被成功克隆，但获得克隆动物成体的成功率一直很低，其中发育阻滞的重构胚普遍存在遗传和发育方面的问题。越来越多的研究显示重构胚遗传和发育中的诸多问题都可归因于核移植后的重编程过程，遗憾的是其分子机制尚不清楚。重编程分子机制是当今动物克隆研究亟待解决的重要科学问题，阐明重编程分子机制是提高克隆效率，增强克隆成体存活能力的关键所在。本项目以斑马鱼体细胞重构胚为模型，研究核移植后重构胚早期发育的重编程分子机制。从胚胎、细胞和分子水平比较分析了不同细胞类型的供体体细胞核核移植后重构胚的发育特征，证明了dome stage和shield stage时期是重构胚核移植后关键的发育时期；通过抑制性差减杂交技术获取了dome stage和shield stage重构胚相对于受精胚差异表达基因谱；筛选和鉴定了klf4, mycb和B97是斑马鱼体细胞核移植后重构胚重编程过程中关键因子；构建了高效敲除斑马鱼基因的TALENs平台，用于进一步研究这些关键因子的体内生物功能。负责人顺利完成了项目申请时拟定的研究任务，为阐明克隆动物发育的重编程机制提供重要的科学数据和构建了相关研究关键技术。