基于生物发光共振能量转移的均相竞争免疫方法检测咖啡中赭曲霉毒素A的研究

Coffee is one of the three most-popular beverages in the world, and its safety are of paramount importance. Ochratoxin A (OTA) is a key risk factor threatening the safety of coffee. In order to minimize the health risk, the OTA limits in coffee has been established in 2017.Due to the complexity of the coffee matrix, the existing national standard only provides instrument detection methods in the absence of rapid detection methods. Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) is a novel highly sensitive optical analysis technique that eliminates the external light source, which can reduce the interference of matrix background and scattered light, has significant advantages for the analysis of complex matrix samples. This project intends to utilize OTA in coffee as the test object, nano-luciferase as BRET donor, near-infrared quantum dot as acceptor, and nanobody as the connecting arm between donor/receptor, aiming to explore the influence of the distance between donor and acceptor, donor quantum yield, overlap ratio between donor emission spectrum and acceptor absorption spectrum, and immune reaction efficiency on BRET energy transfer efficiency. To establish a novel method based on BRET homogeneous competitive immunoassay for sensitive dectection of OTA. Meanwhile, systematically research was conducted for anti-coffee matrix interference, to provide a theoretical basis for the establishment of anti-matrix interference, sensitivity and rapid detection methods for small molecules.

咖啡是世界三大饮料之一，其质量安全至关重要。其中，赭曲霉毒素A（OTA）是威胁咖啡质量安全的关键风险因子。2017年，国标《食品中真菌毒素限量》新增咖啡中OTA的限量标准，但是由于咖啡基质复杂，现有国标只提供仪器检测方法，而未提供快速检测方法。生物发光共振能量转移（BRET）是一种高灵敏的光学分析技术，其内源性发光特性，可减少基质背景荧光和散射光的干扰，对基质复杂样品的分析，具有明显优势。本项目拟以咖啡中的OTA为检测对象，纳米荧光素酶为BRET供体，近红外量子点为受体，纳米抗体为供/受体之间的连接臂，旨在探讨供/受体之间距离、供体量子产率、供体发射光谱与受体吸收光谱之间的重叠率以及免疫反应效率等因素，对BRET能量转移效率的影响，进而建立基于BRET的OTA高灵敏均相竞争免疫检测方法，并系统性开展抗咖啡基质干扰的研究。为建立抗复杂基质干扰，针对小分子物质的高灵敏快速检测方法提供理论依据。

咖啡是世界三大饮料之一，其质量安全至关重要，赭曲霉毒素A（OTA）是咖啡中最常见的真菌毒素之一。当前，国标《食品中赭曲霉毒素A的测定》对于咖啡样品，只有基于液相/液质联用的仪器检测方法。对于基层执法部门及企业，仪器检测方法显然不能满足其对咖啡质量安全进行日常监测的实际需求。因此，建立操作简便的快速检测方法不仅具有较强的应用价值，也是对OTA国标检测方法的有益补充。项目负责人在青年基金的资助下，开发了一系列高灵敏、快速检测咖啡中OTA的免疫分析方法，具体如下：.（1）、基于Nb28-Nluc建立了生物发光免疫分析方法，其可在3小时内完成对咖啡中OTA的快速检测， LOD为3.7 ng/mL；.（2）、开发BRET的能量转移供体（Nb28-Nluc）和受体（QDs-OTA），并证实基于BRET体系建立检测OTA的均相免疫分析方法具有可行性；.（3）、利用蛋白自组装技术开发了七价纳米抗体（Nb28-C4bpα），并基于Nb28-C4bpα分别提出了三种提高检测咖啡中OTA免疫分析灵敏度的方法：（I）构建基于Nb28-C4bpα的ELISA方法。实验发现，Nb28-C4bpα-ELISA的IC50和LOD分别为0.13 ng/mL和0.009 ng/mL，比单体ELISA降低了26.54和175.56倍，考虑咖啡基质后，其LOD为1.5 μg/kg；（II）在开发Nb28-C4bpα的基础上，进一步开发了与链霉亲和素结合肽（SBP）组合的融合蛋白（Nb28-C4bpα-SBP），并基于Nb28-C4bpα-SBP和SA-PolyHRP构建了双重信号放大ELISA。结果表明，双重信号放大ELISA的灵敏度分别比基于Nb28-C4bpα-SBP和SA-HRP以及Nb28-SBP和SA-HRP的ELISA提高了约12.89倍和74.66倍。考虑咖啡基质后，其LOD为15 ng/kg；（III）在双重信号放大ELISA的基础上，为了减少抗体用量，进一步扩大信号强度，引入了酪酰胺信号放大（TSA）系统，并构建了基于Nb28-C4bpα-SBP、TSA和SA-PolyHRP的三重信号放大ELISA，其LOD为183.6 ng/kg。. 项目负责人开发的免疫分析方法展示出较好的实用性，同时，项目负责人提出的信号放大策略对于提高各类免疫分析方法的灵敏度具有借鉴意义。