铝胁迫下丹波黑大豆根中IAA对质膜H+-ATPase活性的调节参与柠檬酸分泌的机理研究

Organic acid exudation is an important mechanism of plant aluminum (Al) resistance. The preliminary study of this project showed that endogenous IAA contents was positively related to plasma membrane (PM) H+-ATPase activity and this enzyme was involved in citrate exudation in Al resistant soybean (Glycine max L. cv. Tamba Black, RB) root under Al stress. Since IAA regulation of the PM H+-ATPase acitivity was reported to participate in plant response to various stresses, it is reasonable to hypothesize that this regulation may be involved in Al-induced citrate exudation in RB roots. In this study, we will investigate the effect of IAA on gene and protein expression of H+-ATPase and 14-3-3 protein, the H+-ATPase phosphorylation and its interaction with 14-3-3 protein. These results will charify the mechanism of IAA regulation of the PM H+-ATPase activity is involved in aluminum-induced citrate exudation in RB roots. Furthemore, the mechanism will be verified using eir1-1 mutant and GmPIN2 transgenic Arabidopsis, in which IAA content was blocked or enhanced. We hope this project will be helpful to disclose the mechanism of IAA involving in citrate exudation and provide novel breeding strategy and gene target to enhance plant Al resistance.

有机酸分泌是植物抗铝胁迫的一种重要机制。本项目的前期研究发现，铝胁迫下丹波黑大豆（RB）根内源IAA含量与质膜H+-ATPase活性呈正相关，且质膜H+-ATPase在调控铝诱导的柠檬酸分泌中起重要作用。此外，已有研究表明IAA对质膜H+-ATPase的调节参与多种胁迫应答，因此我们推测RB根中IAA对质膜H+-ATPase活性的调节可能参与铝诱导的柠檬酸分泌中。本项目拟通过分析铝胁迫下IAA对RB根质膜H+-ATPase和14-3-3蛋白的表达，以及对质膜H+-ATPase磷酸化和与14-3-3蛋白互作的影响，揭示IAA对质膜H+-ATPase活性的调节参与柠檬酸分泌的机制。这个机制将在根中IAA含量改变的eir1-1突变体和过表达GmPIN2的拟南芥中作进一步验证。本项目的实施将有助于我们对IAA参与铝胁迫下柠檬酸分泌调控机制的认识，也为提高植物抗铝能力的分子育种提供新的基因资源和策略

本项目揭示了生长素在丹波黑大豆和拟南芥中调控铝诱导的柠檬酸分泌中的生理和分子机制。铝胁迫诱导了丹波黑大豆根中IAA的累积，这可能与IAA通道蛋白基因GmPIN2的上调表达有关。外源添加IAA缓解了铝对丹波黑大豆植株生长和侧根发育的抑制，并降低了铝含量。与之相关的是，外源添加IAA显著提高了铝胁迫下丹波黑大豆根中质膜H+-ATPase活性和柠檬酸分泌。分子生物学研究结果发现，铝胁迫下外源添加IAA增加了柠檬酸通道蛋白基因GmMATE的表达，而对质膜H+-ATPase基因的表达并没有显著的提高。免疫共沉淀和Western研究结果显示，铝胁迫下IAA增加质膜H+-ATPase的磷酸化和与14-3-3蛋白的互作。以上研究结果表明，外源添加IAA通过增加柠檬酸通道蛋白基因GmMATE的表达、质膜H+-ATPase的磷酸化水平及其与14-3-3蛋白的互作而增强铝诱导的柠檬酸分泌，且该机制在过表达△GHA2基因和质膜H+-ATPase 基因抑制表达的转基因烟草得到了进一步的证实。数字基因表达谱（DGE）分析结果表明，铝胁迫下外源添加IAA通过增强一系列抗铝基因和信号转导相关基因的表达以及有效的逆转铝对丹波黑大豆根正常生命活动相关基因表达的抑制作用而增强丹波黑大豆对铝的抗性。对拟南芥的研究结果发现，PIN2和AUX1参与铝胁迫诱导的IAA在根中的累积。铝胁迫处理下拟南芥pin2和aux1-7突变体植株根系柠檬酸的分泌量和AtMATE的表达均显著低于野生型植株，然而苹果酸分泌量却没有显著性变化。由此可见，铝诱导的PIN2和AUX1的表达和IAA在根中的累积仅参与拟南芥柠檬酸的分泌。与之相关的是，铝胁迫处理后pin2和aux1-7植株质外体pH分别比Col-0增加了12.26%和10.53%，暗示了pin2和aux1-7植株中质膜H+-ATPase的活性高于野生型。以上结果表明，PIN2和AUX1通过调节质子泵的活性和质膜H+-ATPase活性而调节铝诱导的柠檬酸的分泌。综上所述，本项目的研究结果表明，铝胁迫下生长素通过提高柠檬酸通道蛋白基因的表达和激活质膜H+-ATPase而增强铝诱导的柠檬酸的分泌。在本项目的资助下，我们发表论文7篇，包括5篇SCI收录论文，1篇ISTP和1篇中文核心论文。本项目按照预订的计划执行，完成拟定的研究内容和研究目标。