内皮素受体下调介导的配体调控机制在移植肾损伤保护中的作用

The dysregulation of the endothelin system is a key pathophysiological characteristics of renal allograft ischemia-reperfusion injury. Regulation of endothelin system can effectively improve the renal allograft injury. Our previous study showed that downregulation of ETaR led to the reduction of ET-1 expression in renal tissue, thus prevented renal ischemia-reperfusion injury, but its exact mechanism is unclear. In this study, we will establish the rat vascular smooth muscle cells and endothelial cells co-culture model exposed to hypoxia, to elucidate the molecular mechnisms that mediate the downregulation of ET-1 by ETaR downregulation. We would focus on the potential feedback regulation mechanism that the competitive binding of ET-1 with ETbR might activate eNOS, and then increase the synthesis of NO, which further regulate the ET-1 expression. For in vivo study, we will establish the rat allogenic kidney transplant model, downregulate the ETaR expression by specific siRNA, and observe the change of ET-1 expression level, then examine its effect on renal injury, to verify the role of ETaR, ETbR, NO and their signaling pathways in the regulation of ET-1. This study will further reveal the regulation mechanisms of endothelin system and the role in renal allograft ischemia-reperfusion injury, and provide theoretical and experimental basis for clinical renal allograft injury prevention.

内皮素系统的紊乱是移植肾缺血再灌注损伤的关键病理生理特征。调控内皮素系统的活化水平，可有效改善移植肾损伤。我们的前期研究发现，下调肾脏局部ETaR表达水平可反馈抑制ET-1表达，从而有效地保护肾缺血再灌注损伤，但其具体作用机制尚待深入研究。本项目拟通过建立低氧条件下大鼠血管平滑肌细胞-内皮细胞共培养模型，探讨ETaR下调抑制ET-1表达的分子机制，重点研究ET-1与ETbR竞争性结合，激活内皮细胞一氧化氮合酶，增加NO合成，进而调控ET-1表达这一潜在反馈调节机制。通过建立大鼠同系肾移植模型，观察特异性siRNA下调肾脏ETaR表达对ET-1的影响，及其对肾脏损伤的作用，从而进一步探明ETaR、ETbR和NO及其相关信号通路对ET-1表达的调控作用。本研究将进一步揭示内皮素系统在移植肾缺血再灌注损伤中的作用及调控机制，为临床移植肾损伤的预防提供部分理论依据和实验基础。

缺血再灌注是肾脏移植不可避免的过程， 由此造成的缺血再灌注损伤是移植肾功能受损的重要原因。内皮素系统的紊乱是移植肾缺血再灌注损伤的关键病理生理特征。调控内皮素系统的活化水平，可有效改善移植肾损伤。. 本项目通过建立低氧条件下大鼠血管平滑肌细胞-内皮细胞共培养模型，探讨 ETaR下调抑制ET-1 表达的分子机制，重点研究 ET-1与ETbR 竞争性结合，激活内皮细胞一氧化氮合酶，增加 NO 合成，进而调控 ET-1 表达这一潜在反馈调节机制。通过建立大鼠缺血再灌注模型，观察特异siRNA下调肾脏ETaR表达对ET-1的影响，及其对肾脏损伤的作用，从而进一步探明ETaR、ETbR和NO及其相关信号通路对ET-1 表达的调控作用。. 本研究构建的荧光标记的ETaR siRNA可转染进A10细胞内，ETaR siRNA 586较其他两个序列有更高的沉默效率和转染效率。ETaR siRNA可有效下调缺血再灌注损伤后肾脏局部或微缺氧处理后细胞的炎症因子和转录因子的表达，使用eNOS抑制剂L-NAME后可逆转ETaR siRNA保护作用。Western Blot示ETaR siRNA可上调PI3K、AKT、PKG和sGC的表达，使用L-NAME后可逆转上述改变。经肾静脉逆行高压注射ETaR siRNA，能够有效减少肾脏ETaR的表达，同时减少血清肌酐、尿素氮含量，减少肾脏组织病理评分，减少肾实质细胞凋亡。综上所述，ETaR siRNA保护作用可能通过PI3K/Akt信号通路上调eNOS活性，进而通过sGC/PKG信号通路调控核转录因子活性，从而下调ET-1表达。. 本研究初步阐明了ETaR下调导致ET-1表达下调反馈环路的具体机制，探讨了ETaR、ETbR、ET-1的相互调控关系，完善了对内皮素系统自我调节的认识。并进一步阐明了内皮素系统在移植肾缺血再灌注损伤中的作用及调控机制，为临床移植肾损伤的预防提供了部分理论依据和实验基础。