选择性线粒体自噬在移植肾肾小管损伤保护中的作用及机制研究

Renal graft ischemia-reperfusion injury (IRI) may cause acute tubular necrosis, which is the leading cause of delayed graft function (DGF). Unfortunately, there is no effective treatment. Autophagy is an evolutionarily conserved catabolic process in eukaryotic organisms. Studies have revealed that autophagy can degrade mitochondria selectively. This autophagic mitochondrial degradation is termed mitophagy, which plays an important role in the quality control of mitochondria. However, its role in renal graft IRI is still unclear and its mechanism has not been understood clearly. Recent studies demonstrated that the selectivity of mitophagy is regulated by a variety of signaling pathways, including p53-PINK1-Parkin and HIF-1-BNIP3 pathway, which may be activated by different levels of oxidative stress. In this study, we would investigate the role of mitophagy in renal tubular cell injury using in vitro and in vivo models of renal graft IRI. Through using RNA interference, transgenesis techniques and other methods, we would analysis the mechanism of mitophagy regulation under different stress conditions. We hope that research results would help to reduce renal graft tubular injury, reduce the incidence of DGF and provide new ideas for acute kidney injury prevention.

移植肾缺血再灌注损伤（IRI）可造成急性肾小管坏死，严重者表现为移植肾功能延迟恢复（DGF），尚无有效治疗方法。自噬是广泛存在于真核细胞内的一种溶酶体依赖的降解途径，其中通过自噬作用选择性地清除损伤线粒体的过程被称为线粒体自噬。线粒体自噬在维持细胞内线粒体功能和数量稳定方面发挥了重要作用，但其在移植肾IRI中的作用尚不清楚，其机制亦未明确。研究表明线粒体自噬受到p53-PINK1-Parkin和HIF-1-BNIP3等信号通路的特异性调控。最新研究显示线粒体自噬相关调控通路在不同的氧化应激条件下可产生不同的作用。因此本项目拟采用体外及体内移植肾IRI模型，探讨线粒体自噬在IRI后肾小管上皮细胞损伤中的作用，并通过RNA干扰、诱导高表达等方法，分析不同的应激条件下线粒体自噬的调控机制。研究成果有助于减轻移植物损伤，降低DGF 发病率，并为临床急性肾损伤防治提供新思路。

本课题分别通过小鼠盲肠结扎和穿刺（CLP）诱导的急性肾损伤（AKI）模型和小鼠肾脏缺血再灌注损伤（IRI）模型，研究了线粒体去乙酰化酶SIRT3及其参与调控的自噬（线粒体自噬）在肾小管损伤中的作用及其潜在机制。在CLP诱导的小鼠AKI模型和H2O2诱导的HK-2细胞氧化应激损伤模型中，我们研究发现SIRT3通过减少ROS产生、抑制NLRP3炎症小体，减轻氧化应激和下调促炎细胞因子IL-1β和IL-18在肾脏线粒体损伤中发挥保护作用。进一步研究显示，CLP处理的野生型（WT）小鼠肾组织中自噬水平上调，同时伴有磷酸化（p）-AMPK的上调和p-mTOR的下调，而在SIRT3敲除（KO）小鼠中这些效应被抑制。与之相反，SIRT3过表达则可减轻CLP诱导的AKI，促进自噬并显著上调p-AMPK和下调p-mTOR的表达，而自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）和AMPK抑制剂则可在很大程度上消除SIRT3在AKI中的保护作用。这些结果表明SIRT3通过调控AMPK / mTOR途径介导的自噬在CLP诱导的AKI中发挥保护作用。随后在小鼠肾脏IRI模型和NRK52E细胞缺氧/复氧（H/R）模型中，我们研究发现SIRT3通过参与自噬和线粒体自噬的调控在肾脏IRI中发挥保护作用。进一步研究显示，IRI后SIRT3 KO小鼠中自噬被抑制，但线粒体分裂相关蛋白Drp1和线粒体自噬相关蛋白PINK1、Parkin和BNIP3的表达水平则显著升高，线粒体自噬上调，表明SIRT3参与Drp1、PINK1、Parkin和BNIP3的负调控。3-MA应用则会导致IRI损伤加重， 而Drp1抑制剂Mdivi-1则可逆转3-MA的作用，但Mdivi-1的这一逆转效应会被SIRT3缺失所消除，表明Drp1对自噬的调控依赖于SIRT3。而在NRK52E 细胞H/R模型的研究中发现，当SIRT3沉默或Drp1过表达时，自噬标记物LC3-I / II、Beclin-1和COX IV的表达水平降低，表明自噬被抑制。与之相反，当SIRT3过表达或Drp1沉默时，PINK1、Parkin和BNIP3的表达水平降低，提示线粒体自噬被抑制。总之，本课题研究结果表明SIRT3分别通过激活AMPK / mTOR信号通路介导的自噬和抑制Drp1信号通路介导的线粒体自噬在移植肾AKI中发挥保护作用。