活性氧与VEGF信号通路交叉对话参与电磁脉冲致内皮细胞紧密连接开放的机制研究

研究发现，电磁脉冲不仅可以引起血脑屏障的开放，而且可以引起肾小球滤过屏障滤过率的升高、血睾屏障的通透性增加等，从而引发多种生物效应。而在这一过程中， 内皮细胞紧密连接的开放起着重要作用。但是，外界的电磁信号是如何转化为生物信号而引起生物发生功能改变进而造成屏障开放的机制，目前还不清楚。我们的前期实验显示，EMP 可以引起活性氧的产生，同时EMP辐照后VEGF的表达升高，而已知两者在内皮细胞紧密连接的信号调控中都扮演者重要角色，因此，活性氧和VEGF信号通路的交叉对话很可能在EMP 致内皮细胞紧密连接开放中发挥重要作用，为了明确其机制，本课题将应用分子生物学、免疫荧光学、病理学等技术，通过深入研究活性氧、VEGF 信号通路及其之间的交叉对话，在EMP辐照致内皮细胞紧密连接开放中的作用，明确EMP引起内皮屏障通透性增加的信号转导机制，为阐明EMP的生物效应及其作用机理提供重要理论和实验依据。

电磁脉冲（electromagnetic pulse，EMP）对机体健康的影响日益引起关注。内皮屏障的限制性通透性功能在维持机体内环境的稳定，从而保证重要生理功能的正常发挥中发挥重要作用。研究表明，一定参数的EMP照射可引起内皮屏障开放，通透性增加但其发生机制还不清楚。本研究旨在确立一定参数的EMP照射引起内皮屏障开放的时效规律，研究紧密连接蛋白作为内皮屏障重要的结构和功能单位在该生物效应中的变化，并从活性氧的产生和VEGF的表达变化切入，具体分析ROS和VEGF相关信号通路，初步探讨该生物效应中可能的分子机制。实验采用transwell小室共培养RF/6A与C6细胞建立内皮屏障的体外模型，并检测EMP照射对该屏障通透性的影响。通透性的检测指标为跨内皮电阻抗（transendothelial electrical resistance，TEER）及辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase HRP）透过率。二者结果一致表明，EMP照射后，内皮屏障体外模型通透性呈现先增高后恢复的趋势。采用Western Blot法检测RF/6A细胞紧密连接蛋白occludin、claudin-5及ZO-1的表达量，结果显示：与假辐照组比较，EMP照射后occludin及claudin-5 蛋白表达量下调，但ZO-1表达量与假辐照组比较均无统计学差异。对细胞内ROS水平及相关代谢酶类检测结果显示， 在经过24h电磁辐射暴露后，暴露组内皮细胞与假辐照组相比，无论是细胞内ROS荧光强度，还是荧光增强细胞的百分率均明显增高，还可引起活性氧代谢相关酶类及下游信号分子如PP2A表达水平的改变，从而影响氧化还原的平衡状态和屏障系统的功能。采用Western Blot检测VEGF表达水平及下游 MAPK信号通路相关蛋白。结果显示：EMP照射后0.5h，与假辐照组比较VEGF表达水平及下游信号分子p-p38、p-HSP27、p-JNK和p-ERK表达量均上调。当以特异性拮抗剂分别拮抗上述信号分子后，仅有使用p38拮抗剂，能阻滞EMP照射所致occludin及claudin-5蛋白表达下调。由此证明，p38-MAPK信号通路参与EMP照射致内皮屏障通透性增加的分子机制。本研究结果表明，EMP照射导致内皮屏障通透性可逆性增加，ROS水平增高，VEGF表达增加，并进一步通过p38-MAPK